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細(xì)菌總蛋白和膜蛋白提取方法

閱讀：751 發(fā)布時(shí)間：2013-09-04

驗(yàn)試劑

裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，調(diào)pH值8.5-9.0備用；

溶菌酶；蛋白酶抑制劑PMSF；1% SDS溶液；Trizol裂解液；無水乙醇；異丙醇；0.3M鹽酸胍；

疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，調(diào)pH值8.0備用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高速離心機(jī)；超聲儀；透析袋；EP管；渦旋儀；水浴鍋等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 從新鮮樣品中提取總蛋白（簡易法）

1）自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，調(diào)pH值8.5-9.0備用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。

2）將40ml 菌液在12000g，4℃下離心15分鐘收集菌體，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍，沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。

3）超聲粉碎，采用300w，10s超聲/10s間隔，超聲20min，反復(fù)凍融超聲3次菌液變清或者變色。

4） 1000g離心去掉大碎片，上清可直接變性后PAGE電泳檢測，或者用1% SDS溶液透析后凍存。

缺點(diǎn)：Western blotting結(jié)果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

2. 從Trizol裂解液中分離總蛋白

1） Trizol溶解的樣品研磨破碎后，加氯仿分層，2-8℃下10000g離心15min，上層水相用于RNA提取，體積約為總體積的60%。

2）用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3min，2-8℃不超過2000g離心5min。

3）將上清移新的EP管中，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇，室溫放置10min，2-8℃下12000g離心10min，棄上清。

4）用含有0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液，室溫放置20min， 2-8℃下7500g離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。后加入2ml無水乙醇，渦旋后室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清。

5）冷凍干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反復(fù)吹打，50℃溫浴使其*溶解，2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。

6）替代方案：將3中的酚醇上清液移小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g離心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白實(shí)驗(yàn)。

3. 從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污劑法）

1）配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，調(diào)pH值8.0備用。

2）菌液于4℃條件下15000g離心15min收集菌體；用1ml 含有5mM MgCl₂ 的PBS洗滌3次，后于4℃條件下15000g離心15min收集菌體。

3）菌體沉淀加入1ml冷提取液，于4℃條件下放置2h，17000g離心10min，去除沉淀取上清。

4）將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl₂抑制部分蛋白酶活性，37℃條件下放置10min使其分層。室溫下1000g離心10min使液相和去污相充分分層。

5）將液相和去污相分開，分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45min。

6）于4℃條件下17000g離心30min，用去離子水洗滌沉淀3次。

7）將沉淀溶解在1% SDS溶液中，測定蛋白濃度，比較液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白較多，適于進(jìn)一步蛋白實(shí)驗(yàn)。

8） SDS-PAGE進(jìn)一步分析液相和去污相的蛋白圖譜。

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