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上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
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molzym S-040-0100說(shuō)明書
Mastermix 16S Basic，無(wú)DNA
用于使用自定義引物進(jìn)行細(xì)菌和真菌DNA的PCR擴(kuò)增
僅供研究使用
目錄號(hào)編號(hào)S-040-0100 100個(gè)反應(yīng)
目錄號(hào)編號(hào)S-040-0250 250個(gè)反應(yīng)
目錄號(hào)編號(hào)S-040-1000 1000個(gè)反應(yīng)
產(chǎn)品概述
試劑盒/組件
Mastermix 16S堿性 | |||
| 100 rxn | 250轉(zhuǎn) | 1000 rxn |
2.5×預(yù)混液（3 mM Mg2 + 終濃度） | 2 × 0.5 mL | 5 × 0.5 mL | 20 × 0.5 mL |
MolTaq 16S DNA聚合酶（非熱啟動(dòng)） | 0.08 ml | 0.2 ml | 4 × 0.2 mL |
無(wú)DNA的PCR級(jí)水 | 1.7 ml | 3 × 1.7 mL | 10 × 1.7 mL |
產(chǎn)品描述
Mastermix 16S Basic適用于擴(kuò)增細(xì)菌和真菌DNA。Mastermix 16S Basic是一種2.5x濃縮液，反應(yīng)混合物的終體積為25µl。產(chǎn)品包含PCR運(yùn)行所需的所有組分。對(duì)于PCR運(yùn)行，必須加入提供的MolTaq 16S、無(wú)DNA水、定制引物和/或探針和模板以獲得完整的反應(yīng)混合物。
穩(wěn)定性
在適當(dāng)儲(chǔ)存條件下，自生產(chǎn)日期起可穩(wěn)定儲(chǔ)存24個(gè)月。如果包裝材料在到貨時(shí)未損壞且試劑未開封，則在外包裝盒標(biāo)簽上打印的失效日期前確保試劑和緩沖液的全部性能。
應(yīng)用程序
PCR擴(kuò)增法檢測(cè)和鑒定細(xì)菌和真菌
包裝、儲(chǔ)存和處理
在標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施下完成預(yù)混液的純化及其配制，以避免空氣傳播和基于操作的DNA污染。預(yù)混液以無(wú)DNA螺旋蓋小瓶中的2.5x濃縮液形式提供。接收后，將試劑盒中的所有小瓶?jī)?chǔ)存在-15 ℃至-25 ℃下。使用時(shí)，將預(yù)混液和試劑盒的其他組分在冰上解凍，取出等份試樣使用后，再次冷凍儲(chǔ)存。在打開小瓶和處理預(yù)混液期間，注意保持無(wú)DNA的環(huán)境。僅使用經(jīng)認(rèn)證的無(wú)細(xì)菌DNA移液器吸頭和PCR耗材運(yùn)行檢測(cè)。定制的引物、探針和稀釋水可能含有污染的細(xì)菌DNA，將給出假陽(yáng)性PCR結(jié)果。注意僅使用Mastermix 16S Basic的無(wú)細(xì)菌DNA引物、探針和稀釋水。
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質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
使用無(wú)DNA水代替模板DNA的陰性PCR對(duì)照用于分析純化終預(yù)混液中細(xì)菌DNA的污染。保證使用擴(kuò)增大小 > 200 bp的通用16S rDNA引物進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)40個(gè)PCR循環(huán)，陰性對(duì)照中無(wú)信號(hào)的比率≥97%（前提是避免處理錯(cuò)誤導(dǎo)致的污染）。無(wú)DNA的預(yù)混液定義為不產(chǎn)生細(xì)菌DNA特異性信號(hào)。在陰性對(duì)照運(yùn)行中，必須證明凝膠電泳分析中不存在條帶。使用從金黃色葡萄球菌或其他細(xì)菌中提取和純化的已知量基因組DNA運(yùn)行陽(yáng)性對(duì)照?；蛘撸褂肕olzym的DNA陽(yáng)性對(duì)照（目錄號(hào)：否。S-200-050）。
PCR方案
注意所有操作均在無(wú)DNA的環(huán)境（UV輻照工作站）中進(jìn)行。確保塑料耗材（包括PCR小瓶、移液器吸頭、螺旋蓋聚丙烯管）與擴(kuò)增反應(yīng)混合物結(jié)合使用時(shí)無(wú)污染細(xì)菌DNA。按照以下步驟順序工作：
- 在室溫(18-25 ℃)下解凍預(yù)混液。渦旋幾秒鐘以混勻并短暫離心小瓶。4 ℃保存?zhèn)溆?。將MolTaq 16S放入另一個(gè)冷卻架（-15至-25）
℃）。使用后，將組分儲(chǔ)存在-15至-25 ℃下。
- 移取xµl提供的無(wú)DNA水（體積為25µl）至每個(gè)PCR小瓶中。保持小瓶冷卻。
- 加入10µl 2.5x預(yù)混液
- 加入0.5µl正向引物(10µM)
- 加入0.5µl反向引物(10µM)
- 加入0.8µl MolTaq 16S
- 后加入yµl模板。密封小瓶并保持冷卻，直至置于PCR儀中
- 啟動(dòng)特定試驗(yàn)的程序
對(duì)于例如10個(gè)反應(yīng)，使用以下移液方案（加入2µl模板DNA）在無(wú)DNA螺旋蓋或聚丙烯瓶中制備1x預(yù)混液：
- 120µl無(wú)DNA水
- 100µl 2.5x預(yù)混液
- 5µl正向引物(10µM)
- 5µl反向引物(10µM)
共8µl MolTaq 16S 238µl
從該1x預(yù)混液中移取23µl至每個(gè)PCR小瓶中，并加入2µl模板DNA或2µl提供的無(wú)DNA水（陰性PCR對(duì)照）。使用每個(gè)PCR系列，運(yùn)行由從細(xì)菌培養(yǎng)物中提取的DNA標(biāo)準(zhǔn)品（10-100 ng/反應(yīng)）組成的陽(yáng)性對(duì)照。
PCR熱循環(huán)條件：
使用檢測(cè)試劑的特定條件。1x預(yù)混液多可使用40個(gè)循環(huán)。
使用標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳技術(shù)或雜交探測(cè)分析PCR反應(yīng)。
