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公司動態(tài)

慢病毒操作步驟及注意事項

閱讀:1919          發(fā)布時間:2013-7-19

慢病毒操作步驟:

以六孔板中的1孔為例,每個樣品需要1×106個293T細(xì)胞。

1、取1.5ml滅菌EP管,加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒和0.5μg表達(dá)質(zhì)粒以及250μl的無血清培養(yǎng)基。輕柔混勻,室溫孵育5min。

2、取1.5ml滅菌EP管,取9μl 脂質(zhì)體2000l溶于250μl無血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻,室溫孵育5min。

3、將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min

4、用胰酶消化并記數(shù)293T細(xì)胞。用含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

5、在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生長培養(yǎng)基,再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。

6、將1ml重懸的293T細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/ml)加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育。

7、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除,代之以DMEM(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸)。

7、轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min,去除沉淀。

8、病毒上清-80°C貯存。

包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細(xì)胞達(dá)90%以上感染效率。

慢病毒注意事項

1.在慢病毒感染細(xì)胞前,為檢測病毒上清培養(yǎng)液內(nèi)病毒的活性,并確定病毒與轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的比率,需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,然后使用抗體篩選穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染株,進行計數(shù)和數(shù)值統(tǒng)計。

2. 在慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的過程中zui重要的一步是融合,只有一些較小的慢病毒載體才能轉(zhuǎn)導(dǎo)進細(xì)胞,因此,病毒顆粒的吸附是慢病毒轉(zhuǎn)染的限速步驟。.

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