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色譜分析分不開？堵柱子？這招幫你們試過了，有用！
高效液相色譜法是制藥、食品、環(huán)境等行業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)，具有分離效率高，選擇性好，靈敏度高等優(yōu)點。目前，色譜柱填料純度和種類、色譜柱規(guī)格及填充工藝均日益改進，為分析工作者提供了豐富的選擇。同時，流動相的選擇包括有機相的種類、混合比例、添加劑和pH值等，選擇合適的流動相對于液相色譜的分析至關(guān)重要。流動相通常是由水和有機溶劑(如：乙腈、甲醇等)組成的混合溶液，一般可通過添加三乙胺、乙酸銨、甲酸、乙酸、三氟乙酸等來提高分離度或改善色譜峰形。因此，在高效液相色譜分析方法開發(fā)過程中，固定相和流動相的選擇是實現(xiàn)良好分離效果的關(guān)鍵之一。
在分析方法開發(fā)或使用過程中，流動相添加劑選擇或使用不當(dāng)，不僅會導(dǎo)致分離效果不達預(yù)期，甚至可能導(dǎo)致色譜柱或儀器的損壞，因此，流動相、添加劑、離子對試劑等的正確選擇是色譜分析的重中之重。比如：在藥物分析時，由于大多數(shù)藥物是可電離的，即酸性、堿性或兩性離子。一般情況下需要通過加入pH調(diào)節(jié)劑、緩沖鹽等添加劑，抑制樣品組分解離或與待測組分“結(jié)合”，從而實現(xiàn)組分合理保留并獲得良好峰型的目的。常見的流動相添加劑包括：磷酸鹽緩沖液、銨鹽緩沖液、三氟乙酸、三乙胺、離子對試劑等。
離子對試劑應(yīng)用簡介
離子對試劑主要用于液相色譜法分析中，當(dāng)樣品電離能力較強時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留。這時需要加入相應(yīng)的離子對試劑，將分析物上的離子進行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子，從而將其留住。離子對試劑主要用于提高高效液相色譜的分離效果。當(dāng)使用液相色譜法分析電離能力比較強的樣品時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應(yīng)的離子對試劑。離子對的疏水性越強，其在反相固定相上的保留越大，從而達到樣品分離的目的。
以離子對試劑在強堿性/強酸性化合物分離中的應(yīng)用為例：分析物為強堿性化合物，通常會在流動相中添加烷基磺酸鹽離子對試劑，如：戊烷磺酸鈉等；分析物為強酸性化合物，通常流動相中會添加四烷基銨鹽或烷烴銨鹽離子對試劑，如：四丁基溴化銨等，經(jīng)過長時間的色譜柱平衡，流動相中離子對試劑的疏水端（烷基部分），與固定相長鏈強力吸引；親水端（磺酸陰離子或氮正離子）則暴露于固定相與流動相的相界面上。當(dāng)被分析離子化合物進入色譜柱時，強堿性化合物/強酸性化合物與相界面上的磺酸陰離子/氮正離子產(chǎn)生靜電作用，從而產(chǎn)生保留。
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離子對試劑的使用小竅門
當(dāng)使用的離子對試劑疏水性較強（如：烷基磺酸鹽）或季銨鹽試劑（如：四丁基銨）時，柱平衡通常較慢，需要注意基線穩(wěn)定性和保留值重現(xiàn)性。
若發(fā)現(xiàn)選擇的離子對試劑不合適而想換一種離子對試劑時，如果不更換色譜柱，最好先充分清洗掉原來色譜柱中的離子對試劑，再用新流動相平衡色譜柱。不同的離子對試劑有不同的清洗方法，通常建議如下：
· 對于陰離子試劑：建議使用50%~80%的甲醇-水清洗；
· 對于季銨鹽類試劑：建議使用50%甲醇-緩沖劑清洗，其中加入磷酸鉀的目的是降低試劑銨基與硅羥基發(fā)生作用。
離子對試劑對色譜柱的影響：如果使用的離子對試劑疏水性非常強，那么它會在固定相上產(chǎn)生持久的保留，對色譜柱產(chǎn)生不可逆的的改性。因此需要專柱專用，特別在開發(fā)新色譜方法的時候，不要使用這種被改性過的色譜柱。
某些情況下需要嚴(yán)格控制流動相的pH和柱溫，另外，對于要加入揮發(fā)性離子對試劑的流動相，配制時建議在溶劑液面以下放液，避免出現(xiàn)重現(xiàn)性問題。
使用離子對試劑的流動相條件，有時會觀察到同時出現(xiàn)正峰和負峰的現(xiàn)象，這些峰會干擾建立方法或者日常檢測，這類問題主要原因是使用純度不高的離子對試劑、緩沖鹽或者其他其他流動相添加劑等。另外，不純的離子對試劑，也影響分析物的保留時間。
使用含離子對試劑的流動相，特別是疏水性較強的離子對試劑，柱平衡緩慢，如果平衡時間不夠，會出現(xiàn)保留時間漂，結(jié)果不穩(wěn)定的情況，一般建議含離子對試劑的流動相采用等度洗脫條件，因為走梯度，易出現(xiàn)基線波動和保留重現(xiàn)性問題，為保證色譜柱達到較好的平衡狀態(tài)，使用前最好能小流速過夜平衡。
較弱的離子對試劑，如：三氟乙酸、五氟丙酸酐等，這些試劑不會減慢柱平衡過程，通常用流動相平衡10-20倍柱體積就足以達到平衡。當(dāng)樣品中同時含有酸性和堿性化合物時，這兩種離子對試劑都可能有效，但我們不能把這兩種試劑都添加到流動相中，這些試劑之間有形成離子對的趨勢，會抵消它們對分離的凈效應(yīng)，而且同時使用兩種試劑還會使方法建立變得更為復(fù)雜。
當(dāng)需要有選擇性地增加堿性溶質(zhì)的保留時，首選的離子對試劑應(yīng)是烷基磺酸鹽，而四烷基銨鹽則在需要增加酸性溶質(zhì)的保留時應(yīng)用。
通過調(diào)節(jié)流動相，解決堿性化合物的色譜峰拖尾現(xiàn)象
選擇正確的離子對試劑
使用離子對試劑可以增強堿性化合物的保留，改善堿性化合物峰形。適合堿性化合物的離子對試劑主要有：庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、十二烷基烷磺酸鈉等。在酸性條件下，堿性化合物的陽離子會和烷基磺酸根陰離子形成中性離子對，使堿性化合物變成中性化合物，并增強疏水性。
使用三乙胺或二乙胺
當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)堿性化合的峰形出現(xiàn)拖尾時，在流動相里添加1%的三乙胺，再用磷酸把流動相調(diào)回酸性。在酸性條件下，三乙胺陽離子和鍵合相中游離的硅羥基結(jié)合，占據(jù)鍵合相中所有與堿性化合物作用的活性中心，屏蔽堿性化合物的二級作用，從而改善峰形。其中二乙胺相比三乙胺，沸點更低，更加適合LC-MS質(zhì)譜檢測。
調(diào)整流動相pH值
對堿性化合物來說，流動相的pH不僅僅對峰形，還對保留因子和選擇性都有很大影響。一般來建議堿性化合物的流動相 pH≤2.5，會有比較好的峰形。
選擇高純度的緩沖鹽
讓流動相維持在一個相對穩(wěn)定的pH條件下；同時增加流動相足夠的離子強度。高濃度緩沖鹽中金屬離子“包裹”游離硅羥基，并呈正電狀態(tài)，阻斷堿性化合物與固定相的二級反應(yīng)，減小拖尾，改善峰形。緩沖鹽的弱酸根（陰離子）作用是維持流動相體系在一個穩(wěn)定的pH環(huán)境，提高方法重現(xiàn)性。同時，在選擇緩沖鹽/添加劑時要確保緩沖鹽和添加劑與固定相兼容。
常用離子對試劑、緩沖鹽、改進劑等
LiChropur™離子對試劑產(chǎn)品特色
? 純度可達99%以上：易形成穩(wěn)定的離子對，提高待測樣品的分離度和重現(xiàn)性；
? 低紫外吸收：250 nm下紫外透光率≥98%；200 nm下紫外透光率≥70%，提高檢測靈敏度，有效減少流動相在紫外檢測器中的吸收，從而降低背景噪音；
? 低水分含量、良好的化學(xué)穩(wěn)定性：不會與流動相發(fā)生反應(yīng)，適用于不同的流動相組合和檢測條件；
? 溶解性高：可在流動相中均勻分布，以便獲得一致性的分離效果，避免堵塞色譜柱或有鹽類析出導(dǎo)致清洗困難等；
