在靜態(tài)條件下測量細胞粘附

John L. Magnani?GlycoTech Corporation，Rockville，Maryland 20850

任何不同的分子已被描述為促進包括幾個細胞表面碳水化合物結合蛋白的細胞粘附。由于通過洗滌孔產(chǎn)生的剪切力，在方便的96孔微量滴定板形式中測量細胞粘附是困難的。該協(xié)議引入使用充滿液體的洗滌室，其通過重力分離未結合的細胞，由此消除不受控制的剪切力和粘附細胞通過液體/空氣界面的通道。雖然也可以使用放射性標記物等其他方法，但為了檢測，用熒光染料（6-羧基熒光素二乙酸酯）裝載細胞。該方案對于分析促進或抑制細胞粘附的分子也是有用的。

材料：

協(xié)議：

1.將細胞粘附分子與100ng HEPES CaMg緩沖液中的200ng細胞粘附分子一起孵育2小時，將96孔微量滴定板包上細胞粘附分子。在37℃下。

2.通過加入100μl2％BSA的HEPESCaMg /孔，進一步阻斷塑料孔的非特異性結合。在室溫下孵育1小時。

3.用HEPESCaMg緩沖液手動或使用96孔自動洗板機清洗微量滴定板。

4.用100μl含有1％BSA的HEPESCaMg緩沖液填充孔或在每孔中加入100μl含有1％BSA的HEPESCaMg緩沖液中的細胞粘附試驗抑制劑并溫育2小時。在室溫下。

5.在培養(yǎng)期間，用6-羧基熒光素二乙酸酯（6-CFDA）負載測試細胞如下：

A.用RPMI 1640清洗細胞懸液

B.將細胞重懸于4.8ml的RPMI 1640中

C.加入200μl溶解在RPMI 1640中的1mg / ml的6-CFDA溶液

D.在37°C孵育30分鐘。

E.用HEPESCaMg緩沖液洗滌細胞3次

F.調(diào)整細胞濃度至2×10 ^6個細胞/毫升。

6.加入100μl6 -CFDA負載的細胞（2×10 ^6個細胞/ ml）到含有100μlHEPESCaMg的包被孔中。

7.在室溫下孵育20分鐘。

8.將微量滴定板置于靜態(tài)細胞粘附的清洗室中，充滿HEPESCaMg緩沖液并密閉室以消除任何空氣界面和泄漏。

9.翻轉室，使未結合的細胞從孔中脫落6分鐘。在室溫下。

10.將清洗室放在一邊，取下墊片的頂部，用鑷子輕輕地以15度的角度取下蓋板，以確保液體保留在孔中。

11.使用微量滴定板閱讀器如Perseptive Biosystems，Inc。的Cytofluor 2350測量熒光