關(guān)鍵詞:proimmune公司免疫重組細(xì)胞
簡(jiǎn)介：proimmune公司免疫重組細(xì)胞原裝**，質(zhì)量保證。
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我公司是國(guó)內(nèi)信譽(yù)雙收的放心企業(yè)代理商，具有良好的市場(chǎng)信譽(yù)與口碑，我們有一對(duì)一的*的老師對(duì)客戶進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)，專業(yè)的銷售和技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)，歡迎廣大師生、研究機(jī)構(gòu)等，洽商。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
我公司——依托復(fù)旦大學(xué)，集研發(fā)、銷售、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)服務(wù)于一體的高科技企業(yè)。專業(yè)經(jīng)營(yíng)進(jìn)口胎牛血清、細(xì)胞因子、ELISA試劑盒等實(shí)驗(yàn)室試劑、化工產(chǎn)品、實(shí)驗(yàn)室消耗品、實(shí)驗(yàn)室耗材以及實(shí)驗(yàn)室器材。產(chǎn)品涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)菌學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)、細(xì)胞治療、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域。主要產(chǎn)品及服務(wù)： 血清 細(xì)胞 抗體 細(xì)胞因子 試劑盒 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)耗材 技術(shù)服務(wù) 實(shí)驗(yàn)儀器
實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)內(nèi)容。歡迎廣大師生選購(gòu)。
產(chǎn)品價(jià)格：詢價(jià)
用產(chǎn)品只提供給進(jìn)一步的科研使用，不可應(yīng)用于治療等其他方面。
英國(guó)ProImmune 公司是免疫學(xué)功能檢測(cè)多聚體產(chǎn)品和服務(wù)*的*。產(chǎn)品包括重組的MHC Class I 五聚體和MHCClass II 六聚體，用于特異性的T 細(xì)胞免疫功能檢測(cè)。廣泛用于腫瘤，傳染性疾病，自身免疫學(xué)疾病和移植等熱門領(lǐng)域的基礎(chǔ)，新藥和臨床研究。
五聚體(ProImmune)結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色在國(guó)外正在成為很多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。五聚體可用于檢測(cè)和分離少至淋巴細(xì)胞0.02%的抗原特異性CD8+T細(xì)胞群。然而，并不是所有的抗原特異性T細(xì)胞都具有功能，功能性細(xì)胞的比例因個(gè)體和疾病不同而異。可以通過(guò)對(duì)另外的胞內(nèi)細(xì)胞因子聯(lián)合染色來(lái)研究抗原特異性T細(xì)胞的免疫效應(yīng)功能。
細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)免疫反應(yīng)起著重要的作用。細(xì)胞因子作用的范例包括干擾素-γ（IFNγ）誘導(dǎo)產(chǎn)生的許多抗病毒蛋白、IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞增殖、以及腫瘤壞死因子α（TNFα）對(duì)病毒基因表達(dá)和復(fù)制的抑制。細(xì)胞因子不是預(yù)先形成的，而是在受到相關(guān)刺激時(shí)才迅速產(chǎn)生和分泌的。因此，胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色依賴于在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在的情況下（以將細(xì)胞因子截留在細(xì)胞內(nèi)）對(duì)細(xì)胞的刺激。
激起細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞活化一般會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞受體的下調(diào)。因此，如果需要同時(shí)檢測(cè)T細(xì)胞特異性，則應(yīng)在細(xì)胞活化前進(jìn)行Pro5R五聚體染色以確保染色水平。在此期間五聚體可能會(huì)與T細(xì)胞受體一同被內(nèi)化，但仍可以在透化細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到。研究抗原特異性T細(xì)胞的效應(yīng)功能時(shí)，先將細(xì)胞以五聚體染色，然后再用抗原刺激，隨后用針對(duì)細(xì)胞外表位（如CD8）的特異性抗體進(jìn)行染色，zui后再進(jìn)行膜透化和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。
材料和儀器：
1）細(xì)胞樣本（如PBMCs）
2）Pro5RMHC Class Ⅰ五聚體連接熒光標(biāo)記（如R-PE）
3）熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體，如anti-human IFNγFITC; ProImmune(不同熒光標(biāo)記的五聚體)
4）熒光標(biāo)記的CD8抗體
5）肽（儲(chǔ)存在50mg/mL的DMSO中—可分裝保存于-20℃）
6）Leukocyte activation cocktail (LAC; 可選) 作為細(xì)胞因子產(chǎn)物對(duì)照（BD Biosciences#55083—可分裝保存在-80℃）
7）細(xì)胞因子IC對(duì)照細(xì)胞（可選）用于在胞內(nèi)細(xì)胞因子染色時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照（eBioscience#00-4509）
8）PBS緩存液（含2%FCS，0.1%疊氮鈉）
9）Permeabilization緩存液（含0.1%saponin，1%FCS，0.1%疊氮鈉的PBS）
10）4% Paraformaldehyde多聚甲醛
11）Fix buffer（含1%熱滅活小牛血清HI-FCS，2.5%甲醛的PBS）
12）R10培養(yǎng)液（RPMI1640，含10%HI-FCS，10mMHEPES，50mM 2-ME，）
13）Brefeldin A（Sigma #15870）
14）12×75mm 圓底管
15）臺(tái)式冷凍離心機(jī)，水平轉(zhuǎn)子和配套管架
16）冷凍微型離心機(jī)
17）CO2，37℃培養(yǎng)箱
18）渦旋混合器
Pro5R五聚體結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)IFNγ、TNFα、MIP-1β或IL-2
操作步驟：步驟10前的所有操作在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，使用無(wú)菌緩存液和無(wú)菌條件。
1.離心Pro5R五聚體，冷凍微型離心機(jī)（14000×g，5min）。
2.制備外周血細(xì)胞，PBS中細(xì)胞濃度2×107cells/ml。
3.分別將細(xì)胞懸液50μl加入到多個(gè)試管中。
4.添加熒光標(biāo)記的五聚體到需要的試管中，22℃孵育10min（無(wú)刺激的信號(hào)對(duì)照在該步驟時(shí)不要染色）。在剩下的試管中加入10μl的PBS。
5.在每個(gè)管中加入500μlPBS，離心450×g，5min，10℃。
6.去掉上清液，震動(dòng)分散細(xì)胞，用200μl的R10培養(yǎng)液重懸。
7.用R10培養(yǎng)液1:50稀釋肽蛋白原液。取2μl（終濃度10μg/ml）加入到需要的管中。
如果使用LAC作為對(duì)照，在37℃水浴中快速?gòu)?fù)溶，取0.33μl至每個(gè)需要的管。使用后，丟棄剩下的LAC。
8.將試管置于37℃，加濕CO2培養(yǎng)箱中孵育15min-1h。
9.加入Brefeldin A（終濃度10μg/ml）到需要的管中（注意：LAC中含有Brefeldin A），重新放回培養(yǎng)箱中孵育15h。孵育中產(chǎn)生特定細(xì)胞因子的*刺激階段是不同的，是需要確定的。上述實(shí)驗(yàn)中16h的孵育時(shí)間是對(duì)人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ的*孵育時(shí)間。根據(jù)刺激方法和選擇的細(xì)胞因子效應(yīng)，孵育時(shí)間各不相同。
10.從培養(yǎng)箱中取出試管，離心450×g，5min，10℃。
11.去除上清，在需要的管中用50μl含*濃度的anti-CD8抗體的PBS重懸細(xì)胞，其它管中加50μlPBS。
信號(hào)-顏色對(duì)照在此步驟時(shí)染色。另外，如果需要樣本額外的亞型，針對(duì)其它細(xì)胞表面標(biāo)志或受體的抗體也在這時(shí)加入。
12.冰上孵育20min。
13.每管加入500μlPBS洗滌，離心450×g，5min，10℃。
14.去除上清，震動(dòng)分散細(xì)胞。
15.每個(gè)樣本管加入200μl 4% Paraformaldehyde，渦旋混勻。冰上孵育20min。
此步中要固定活細(xì)胞形態(tài)。
此步時(shí)操作可以暫停，重復(fù)進(jìn)行13和14步，重懸細(xì)胞，100μlPBS/管，遮蓋管口，細(xì)胞放4℃可儲(chǔ)存3天。再次進(jìn)行操作時(shí)，重復(fù)步驟13和14，重懸細(xì)胞每管200μl Permeabilization，然后進(jìn)行步驟17。
16.每管加入200μl Permeabilization。
17.離心450×g，5min，10℃，棄上清。
18.樣品管加入100μl Permeabilization，用抗細(xì)胞因子抗體染色。在剩余管（如信號(hào)-顏色對(duì)照）中加入100μl的PBS。
19.室溫孵育5min。
20.加入*濃度的FITC-抗細(xì)胞因子抗體到需要的樣品管中，混勻。
21.室溫孵育20min。
22.每管加入200μl Permeabilization，離心450×g，5min，10℃，棄上清，震動(dòng)分散細(xì)胞。
23.200μl Fix buffer重懸細(xì)胞，渦旋混勻。
加入固定液時(shí)渦旋是很重要的，以使細(xì)胞不會(huì)成團(tuán)。
注意：
1.孵育階段：特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)刺激的*時(shí)間是不同的需要確定的。上述實(shí)驗(yàn)中16h的孵育時(shí)間是對(duì)人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ的*孵育時(shí)間。根據(jù)刺激方法和選擇的細(xì)胞因子效應(yīng)，孵育時(shí)間各不相同。
2.肽蛋白濃度：調(diào)查細(xì)胞因子反應(yīng)效應(yīng)的滴度。
3.五聚體染色：細(xì)胞活化產(chǎn)生細(xì)胞因子可能會(huì)使T細(xì)胞受體下調(diào)，這會(huì)影響隨后的五聚體染色，所以，推薦五聚體在細(xì)胞活化之前染色。
4.抗體濃度：調(diào)查anti-CD8和anti-cytokine抗體的有效滴度。anti-CD8抗體滴度會(huì)阻止其它抗體介導(dǎo)的封閉或與五聚體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的位點(diǎn)。
5.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制：Brefeldin A抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中BrefeldinA菌的存在會(huì)阻止蛋白質(zhì)在高爾基復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)，使蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。Brefeldin A菌會(huì)增強(qiáng)大多數(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)，所以，建議在特定的實(shí)驗(yàn)中需要檢查實(shí)驗(yàn)試劑的有效性，是否含有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)制抑制劑（如Monensin）。
6.背景染色：當(dāng)進(jìn)行五聚體染色時(shí)，如果背景染色過(guò)高，需先用Fc封閉或10%小鼠血清來(lái)封閉細(xì)胞。其它減少非特異染色的方法可參見(jiàn)ProImmune相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)。
7.如果需要沒(méi)有五聚體結(jié)合的胞內(nèi)細(xì)胞因子染色則去掉實(shí)驗(yàn)步驟1-4
所有這些產(chǎn)品均具有*的純度和高超的品質(zhì)。完善的庫(kù)存及供應(yīng)體系以及高效穩(wěn)定的純化技術(shù)，保證產(chǎn)品均能現(xiàn)貨供應(yīng)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。