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 實時熒光定量 PCR技術原理

 

   聚合酶鏈式反響 （ PCR） 可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應完畢之后，我們能夠經(jīng)過凝膠電泳的辦法對擴增產(chǎn)品進行定性的分析，也能夠經(jīng)過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的剖析。無論定性或是定量剖析，剖析的都是PCR終產(chǎn)品。所謂的實時熒光定量PCR即是通過對PCR擴增反響中每一個循環(huán)產(chǎn)品熒光信號的實時檢測然后完成對開始模板定量及定性的剖析。在實時熒光定量PCR反響中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，跟著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)品不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。

 

 

熒光擴增曲線擴增曲線能夠分紅三個期間

 

熒光背景信號階段, 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光布景信號所掩蓋，我們無法判別產(chǎn)品量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)品已不再呈指數(shù)級的增長。 PCR 的終產(chǎn)品量與開始模板量之間沒有線性關系，所以依據(jù)后的 PCR 產(chǎn)品量不能計算出開始 DNA 拷貝數(shù)。只要在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR 產(chǎn)品量的對數(shù)值與開始模板量之間存在線性關系，咱們能夠挑選在這個階段進行定量分析。為了定量和對比的便利，在實時熒光定量 PCR 技能中導入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它能夠設定在熒光信號指數(shù)擴增期間任意方位上。每個反應管內(nèi)的熒光信號抵達設定的域值時所閱歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（threshold value）。