在培養(yǎng)箱內(nèi)對細(xì)胞相互作用進(jìn)行熒光觀察，是一種能在接近細(xì)胞生理環(huán)境（穩(wěn)定的溫度、濕度、CO?濃度等）下，實(shí)時、動態(tài)追蹤細(xì)胞間相互作用的技術(shù)，尤其適用于需要長時間觀察的實(shí)驗。以下是該技術(shù)的關(guān)鍵要點(diǎn)：

一、核心設(shè)備要求

要實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)箱內(nèi)熒光觀察，需專用設(shè)備組合，確保不干擾細(xì)胞存活且能精準(zhǔn)捕捉熒光信號：

培養(yǎng)箱集成式熒光顯微鏡

直接將熒光顯微鏡模塊嵌入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)部，或通過密封接口連接外部顯微鏡，避免頻繁取出細(xì)胞導(dǎo)致環(huán)境波動。例如：

Incucyte® S3/S2（進(jìn)口）：培養(yǎng)箱內(nèi)集成熒光成像模塊，支持明場和多通道熒光（GFP、RFP 等），可長期自動拍攝。

國產(chǎn) CytoSMART Lux3 FL：小型化培養(yǎng)箱內(nèi)熒光顯微鏡，支持 3 通道熒光，通過 APP 遠(yuǎn)程監(jiān)控，適合中小規(guī)模實(shí)驗。

核心功能：維持 37℃、5% CO?、95% 濕度環(huán)境，避免熒光激發(fā)光對細(xì)胞的光毒性（需低強(qiáng)度 LED 光源）。

熒光標(biāo)記策略

對目標(biāo)細(xì)胞或分子進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記，確保相互作用可被可視化：

細(xì)胞標(biāo)記：用不同熒光染料（如 CFSE 標(biāo)記細(xì)胞 A，CellTracker Red 標(biāo)記細(xì)胞 B）區(qū)分兩種細(xì)胞，觀察其聚集、接觸或遷移軌跡。

分子標(biāo)記：通過基因編輯（如 GFP 融合蛋白）標(biāo)記細(xì)胞表面受體（如免疫細(xì)胞的 CD4、腫瘤細(xì)胞的 PD-L1），或配體（如細(xì)胞因子），實(shí)時追蹤分子在相互作用中的動態(tài)（如受體聚集、內(nèi)化）。

相互作用特異性標(biāo)記：如 “熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）"，當(dāng)兩細(xì)胞表面分子結(jié)合時，供體熒光（如 CFP）向受體熒光（如 YFP）轉(zhuǎn)移能量，通過信號變化反映相互作用強(qiáng)度。

二、觀察與成像方法

時間序列成像

設(shè)定拍攝間隔（如每 10 分鐘 1 次），連續(xù)數(shù)小時至數(shù)天，記錄細(xì)胞相互作用的動態(tài)過程（如免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的識別→接觸→殺傷，或神經(jīng)元突觸形成）。

注意控制熒光激發(fā)時間和強(qiáng)度：過長或過強(qiáng)的激發(fā)光會導(dǎo)致細(xì)胞活性下降（光毒性），需通過預(yù)實(shí)驗優(yōu)化參數(shù)（如每次曝光≤50ms，間隔≥30 分鐘）。

多通道與共定位分析

同時采集明場和多個熒光通道圖像（如 DAPI 染核 + GFP 標(biāo)記細(xì)胞 A+RFP 標(biāo)記細(xì)胞 B），通過軟件疊加分析細(xì)胞間的空間關(guān)系（如是否直接接觸、接觸區(qū)域的分子共定位）。

三、數(shù)據(jù)分析重點(diǎn)

結(jié)合時間序列熒光圖像，可通過軟件量化細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵參數(shù)：

相互作用動態(tài)參數(shù)

接觸頻率：單位時間內(nèi)兩細(xì)胞接觸的次數(shù)；

接觸時長：單次接觸持續(xù)的時間；

距離變化：細(xì)胞間中心距離隨時間的變化（反映趨近或遠(yuǎn)離趨勢）。

熒光信號分析

熒光強(qiáng)度變化：如細(xì)胞接觸后，標(biāo)記分子（如炎癥因子）的熒光強(qiáng)度升高，提示信號激活；

共定位系數(shù)：通過 ImageJ 或 CellProfiler 計算兩種熒光信號的重疊程度（如受體 - 配體在接觸界面的共定位）。

細(xì)胞行為關(guān)聯(lián)

結(jié)合細(xì)胞運(yùn)動軌跡（如通過 TrackMate 插件追蹤），分析相互作用與細(xì)胞遷移速度、方向改變的關(guān)系（如 T 細(xì)胞接觸靶細(xì)胞后是否減速并停留）。

四、應(yīng)用場景

免疫學(xué)：觀察 T 細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的免疫突觸形成、NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的識別與殺傷過程。

腫瘤學(xué)：追蹤巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用（如 “吞噬" 或 “促轉(zhuǎn)移" 傾向），或腫瘤細(xì)胞間的抱團(tuán)遷移。

神經(jīng)科學(xué)：記錄神經(jīng)元突起與膠質(zhì)細(xì)胞的接觸動態(tài)，或突觸形成過程中熒光標(biāo)記蛋白（如突觸素 Synapsin-GFP）的聚集。

發(fā)育生物學(xué)：觀察胚胎發(fā)育中細(xì)胞間的黏附、分化信號傳遞（如干細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞的相互作用）。

五、注意事項

環(huán)境穩(wěn)定性：確保培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、CO?濃度無波動（避免成像時開門或設(shè)備散熱影響）。

光毒性與漂白：優(yōu)先選擇低光毒性熒光染料（如 Alexa Fluor 系列），并降低激發(fā)光強(qiáng)度和曝光時間。

圖像存儲與處理：長時間成像會產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)（如 2000 萬像素圖像每小時 1GB），需配備大容量存儲和自動化分析軟件（如 Incucyte Analysis Software、Harmony）。

通過該技術(shù)，可直觀揭示細(xì)胞相互作用的動態(tài)規(guī)律，為理解生理或病理機(jī)制提供關(guān)鍵可視化證據(jù)。