肝細胞癌（HCC）是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復雜的多因素過程，一般受癌細胞周圍微環(huán)境的調(diào)控。

在腫瘤微環(huán)境中，0.1-2 dyne/cm² 的流體剪切應力（FSS）已被證實可促進腫瘤相關的血管生成和淋巴管生成，這可能會改善癌細胞的移動性和侵襲性。研究還表明，1.4 dyne/cm² 層流FSS可以顯著增強HCC細胞的遷移。然而，機械應力如何調(diào)節(jié)細胞遷移的機制仍然知之甚少。

到目前為止，自噬在癌癥進展中的作用已被廣泛探索并且對包括FSS在內(nèi)的多種微環(huán)境刺激具有響應性。根據(jù)之前的研究結果，1.4 dyne/cm² FSS 可以以時間依賴性方式誘導自噬的發(fā)生，隨后通過整合素/細胞骨架通路促進 HepG2 細胞的遷移和侵襲。然而，參與 FSS 誘導的細胞遷移的下游通路仍需要進一步探索。

近年來，上皮-間充質(zhì)轉化（EMT）由于與癌細胞遷移和侵襲的密切關系而備受關注。自噬在 EMT 過程中也起著至關重要的作用。然而，在腫瘤進展過程中，尤其是在流體流動條件下，自噬和 EMT 之間是否存在相互作用尚不清楚。

鑒于自噬在癌細胞遷移和侵襲中的作用，來自四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究室、四川大學老年保健和醫(yī)學研究中心的專家學者進行了深入研究，推斷自噬可能涉及流體剪切應力誘導的 EMT。在研究中，對 HepG2 和 QGY-7703 細胞（人HCC細胞系）施加 1.4 dyne/cm² FSS 以鑒定自噬和 EMT 的發(fā)生。相關研究成果發(fā)表在 Molecular Carcinogenesis  題為《Autophagy modulates FSS-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells》。

實驗結果：

FSS在肝癌細胞中誘導自噬

為了進一步驗證FSS對自噬發(fā)生的影響，對自噬相關標志物的表達進行了研究。結果所示，EBSS 饑餓誘導的 beclin1、ATG7 和 LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，p62 表達下調(diào)，而 p62 可被 3-MA 抑制。

在 HepG2 細胞中，與靜態(tài)對照相比，FSS 刺激 1 和 4h 均能顯著上調(diào) beclin1、ATG7 的表達，以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，表明 FSS 可以誘導 HepG2 細胞的自噬。在 QGY-7703 細胞中可以觀察到類似的結果。

不同的是，在HepG2細胞中，beclin1、ATG7、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達和p62的下調(diào)在4 h時更為明顯，而QGY-7703細胞在1 h時表達更明顯。有趣的是，隨著FSS持續(xù)時間的延長，自噬相關蛋白的表達可能會發(fā)生變化，其隨細胞系的不同而表現(xiàn)出不同的時間依賴性。

FSS誘導EMT的發(fā)生

以往的研究表明，EMT的發(fā)生是對流體剪切應力刺激的響應。在本研究中，對HepG2和QGY-7703細胞分別施加1.4 dyne/cm2流體剪切應力作用1和4 h。結果所示，與靜態(tài)對照組相比，FSS在 1 和 4 h 顯著下調(diào)上皮標志物 E-cadherin 的表達，同時上調(diào)間充質(zhì)標志物 N-cadherin、Vimentin、Twist 和 Snail 的表達，表明HepG2 細胞中 EMT 的發(fā)生。

抑制自噬影響FSS誘導的EMT相關標志物的表達和定位

最近的研究表明，自噬刺激可以通過調(diào)節(jié)癌細胞的上皮和間充質(zhì)表型之間的轉化來增加細胞遷移能力。因此，實驗進一步探討了自噬是否會在暴露于 FSS 時影響 EMT。

結果所示 , 與相應的 FSS 組 (1 和 4 h 組) 相比, 添加自噬抑制劑 3-MA 導致 1 h + 3MA 組的 E-cadherin 水平恢復上調(diào), 而HepG2 細胞中 1 h + 3MA 和 4 h + 3MA 組中 N-cadherin、Vimentin、Twist 和 Snail 水平均顯著降低。同樣，當3-MA阻斷自噬后，QGY-7703細胞中E-cadherin表達升高，N-cadherin表達降低，也證實了EMT的衰減。

為了進一步證實這一結論，當暴露于 FSS 1h時，通過敲低 ATG5 或添加自噬抑制劑 CQ 來抑制自噬。結果表明，抑制自噬阻礙了 FSS 誘導的 HCC 細胞的 EMT。

總的來說，這些結果表明，自噬積極促進了 FSS 誘導的 HCC 細胞 EMT 的發(fā)生。

抑制自噬可阻斷 FSS 誘導的 β-catenin 在細胞核中的積累

β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是一種間充質(zhì)標記物，它從E-鈣粘蛋白分離到細胞質(zhì)中，然后易位到細胞核中，對EMT有重要作用。為了進一步證實自噬在 FSS 誘導的 EMT 中的作用，在 HepG2 和 QGY-7703 細胞中檢測了 β-連環(huán)蛋白的表達和分布。

結果顯示，與靜態(tài)對照相比，β-catenin 的表達水平在 FSS 刺激 1 h和 4 h內(nèi)上調(diào)，而隨著 3-MA 在兩種細胞中的加入，β-catenin在細胞核內(nèi)明顯減少并易位至細胞膜，表明FSS誘導的自噬可以誘導β-catenin的核易位。

這些結果表明 FSS 可以促進 EMT 的發(fā)生，而 EMT 可以通過抑制自噬而減弱。

抑制自噬損害 FSS 誘導的細胞遷移

自噬已被證實正調(diào)控EMT的發(fā)生，實驗假設自噬可能有助于HCC細胞的遷移。該研究采用F-肌動蛋白染色檢測HCC細胞的遷移能力。結果表明，在 FSS 條件下，自噬的抑制顯著阻礙了 F-肌動蛋白的聚集和重組，這是細胞遷移所必需的。

為了進一步證實自噬對 EMT 的影響，進行了傷口愈合試驗以檢測 HCC 細胞的遷移能力。當暴露于流體剪切應力時，在HepG2細胞中發(fā)現(xiàn)1和4 h組細胞的遷移距離分別長約1.4和1.5倍，而在QGY-7703細胞中，在24 h時，其遷移距離分別是對照組的1.2倍和1.3倍。

因此，1.4 dyne/cm²  FSS對HCC細胞的遷移有重要作用。然而，與 1 h 和 4 h 組相比，3-MA 的添加分別顯著降低了49%和93%的HepG2細胞遷移距離。同樣，QGY-7703細胞的遷移距離分別降低了64%和47%，表明自噬參與了 FSS 誘導的細胞遷移，可能是通過誘導 EMT 的發(fā)生。

實驗結論：

總之，該研究表明自噬參與了 FSS 誘導的 EMT，可以積極促進 HCC 細胞的遷移和侵襲。該研究結果提供了一種新的見解，用于說明肝細胞癌機械微環(huán)境中自噬和 EMT 之間的關系。

參考文獻：Su G, Feng T, Pei T, Yang F, Sun D, Yu H, Wang X, Gao W, He J, Shen Y, Liu X. Autophagy modulates FSS-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells. Mol Carcinog. 2021 Sep;60(9):607-619. doi: 10.1002/mc.23327. Epub 2021 Jun 9. PMID: 34107107.

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