Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells

Keywords: AMPK; KLF4; epigenetics; GCKR; glycolysis.

內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋動脈管腔并直接接觸血流，其中動脈直段的脈動切應(yīng)力（PS）維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，而分叉彎曲處的振蕩切應(yīng)力（OS）會引發(fā)內(nèi)皮功能障礙，表現(xiàn)為糖酵解增強(qiáng)、炎癥、增殖及活性氧生成，進(jìn)而導(dǎo)致動脈粥樣硬化。糖酵解作為內(nèi)皮主要能量來源，其異常與多種疾病相關(guān)，盡管已有研究表明切應(yīng)力通過 KLF2、HIF-1α 等因子調(diào)節(jié)糖酵解，但不同血流模式下的系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制仍不明確。

KLF4 和 AMPK 是內(nèi)皮機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子：KLF4 作為先鋒轉(zhuǎn)錄因子，在 PS 作用下可激活抗動脈粥樣硬化基因并重塑染色質(zhì)；AMPK 作為代謝調(diào)控因子，通過磷酸化靶蛋白調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)。糖酵解限速酶 HK1 可被 GCKR 結(jié)合抑制，而 GCKR 的表達(dá)和修飾動態(tài)調(diào)控糖酵解速率。

鑒于此，研究團(tuán)隊對 KLF4 和 AMPK 在通過 GCKR 調(diào)節(jié) EC 糖酵解中的作用進(jìn)行調(diào)查，并在高運(yùn)動量小鼠的血管健康中進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn) PS 可通過 KLF4 介導(dǎo)的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控上調(diào) GCKR 表達(dá)，并通過 AMPK 磷酸化 GCKR 增強(qiáng)其與 HK1 的結(jié)合，從而抑制糖酵解。研究成果發(fā)表于PNAS 期刊題為“Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells"。

首先，研究團(tuán)隊通過分析 RNA 測序數(shù)據(jù)和 qPCR 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，脈動切應(yīng)力（PS）可從 16 小時起顯著下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中糖酵解途徑相關(guān)酶的基因表達(dá)，而振蕩切應(yīng)力（OS）則呈現(xiàn)相反作用（圖 1A和1B）。結(jié)合 ATAC-seq 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，PS 對糖酵解基因的抑制與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑相關(guān) —— 在 OS 作用下，糖酵解基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)解聚程度（ATAC 峰富集）顯著高于 PS 處理組（圖 1C）。這表明 PS 在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平上系統(tǒng)性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解過程，為揭示血流動力學(xué)調(diào)控血管代謝的分子機(jī)制提供了證據(jù)。

圖1   PS抑制ECs中糖酵解基因的表達(dá)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PS可顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白（GCKR）的轉(zhuǎn)錄（圖 2A和2B)，且該過程由先鋒轉(zhuǎn)錄因子 KLF4 介導(dǎo)。PS 處理使 GCKR 啟動子區(qū)域的 H3K27ac 組蛋白修飾富集（圖 2C），提示染色質(zhì)結(jié)構(gòu)解聚以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。通過分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及 RNA 測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) KLF4 是 PS 誘導(dǎo)下與 GCKR 啟動子結(jié)合顯著的轉(zhuǎn)錄因子（圖 2D和2E）。過表達(dá) KLF4 可增強(qiáng)其與 GCKR 啟動子的結(jié)合并上調(diào) GCKR 表達(dá)（圖 2 F-H），而敲低 KLF4 則削弱 PS 對 GCKR 的誘導(dǎo)作用（圖 2I和2J）。與這些結(jié)果一致，PS 增加了 KLF4 與 GCKR 啟動子的結(jié)合并增強(qiáng)了 GCKR 表達(dá)（圖 2 B, K 和 L）。在小鼠體內(nèi)，抗動脈粥樣硬化血流模式下的胸主動脈內(nèi)膜中 GCKR mRNA 水平顯著高于致動脈粥樣硬化區(qū)域的主動脈弓（圖 2M）。這些結(jié)果表明 PS 誘導(dǎo)的 GCKR 依賴于 KLF4 介導(dǎo)的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖2   KLF4 響應(yīng)PS調(diào)節(jié)GCKR的表達(dá)。

接著，為了確定 PS 誘導(dǎo)的 GCKR 是否涉及蛋白質(zhì)磷酸化，研究人員通過生物信息學(xué)預(yù)測和體外激酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AMPK 能直接磷酸化 GCKR 的 Ser-481 位點(diǎn)，該位點(diǎn)與 AMPK 磷酸化共有序列高度同源，突變該位點(diǎn)會顯著減弱磷酸化水平（圖 3A和3B）。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，PS 處理可增強(qiáng) GCKR Ser-481 磷酸化，而 AMPK 敲除則消除了這一效應(yīng)（圖 3C）。功能上，磷酸化的 GCKR（如 S481D 模擬物）可增強(qiáng)與 HK1 的結(jié)合，抑制 HK1 活性，而未磷酸化的 S481A 則削弱這種相互作用并提升 HK1 活性（圖 3D和3E）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，AMPKα2 存在時，小鼠胸主動脈中 GCKR Ser-481 磷酸化及與 HK1 的結(jié)合顯著增加（圖 3F和3G）?？傊?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">PS 通過激活 AMPK 介導(dǎo) GCKR Ser-481 磷酸化，促進(jìn) GCKR 與 HK1 結(jié)合以抑制糖酵解關(guān)鍵酶活性，揭示了翻譯后修飾在血流動力學(xué)調(diào)控血管代謝中的關(guān)鍵作用。

圖3   AMPK 磷酸化并調(diào)節(jié)GCKR。

最后，為了證實(shí) KLF4-AMPK/GCKR 在體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解，研究人員通過高跑量（HR）小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證。HR 小鼠因心輸出量增加，主動脈中脈動切應(yīng)力（PS）升高，伴隨 AMPK 活性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)顯示，HR 小鼠主動脈中糖酵解相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)（圖 4A），而 KLF4 與 GCKR 啟動子結(jié)合增強(qiáng)，導(dǎo)致 GCKR 的 mRNA 和蛋白水平顯著升高（圖 4B-D）。同時，AMPK 介導(dǎo)的 GCKR Ser-481 磷酸化及 GCKR-HK1 結(jié)合作用增強(qiáng)（圖 4E和4F） ，進(jìn)而降低 HK1 活性（圖 4G）。這表明有氧運(yùn)動 可能有益于血管內(nèi)皮的能量利用，且這種有益結(jié)果由 GCKR 表達(dá)和活性的增加介導(dǎo)。其潛在機(jī)制應(yīng)分別包括 KLF4 在轉(zhuǎn)錄水平和 AMPK 在翻譯后水平的調(diào)節(jié)（圖 5）。

圖4  KLF4-AMPK/GCKR對HR 小鼠糖酵解的抑制作用。

圖5  PS通過 KLF4 和 AMPK 抑制ECs糖酵解的示意圖。

總之，文章闡明了血流通過機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控血管內(nèi)皮糖酵解的機(jī)制：抗動脈粥樣硬化的脈動切應(yīng)力（PS）在體外和體內(nèi)均可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解。具體而言，PS 可上調(diào)糖酵解抑制劑 GCKR 的表達(dá)，同時下調(diào)其他糖酵解相關(guān)基因。機(jī)制上，PS 誘導(dǎo)的先鋒轉(zhuǎn)錄因子 KLF4 通過表觀遺傳重塑 GCKR 啟動子，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄激活；同時，PS 激活的 AMPK 可磷酸化 GCKR，增強(qiáng)其與糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶的結(jié)合，從而抑制糖酵解通量。本研究為血流動力學(xué)調(diào)控血管代謝及運(yùn)動干預(yù)血管健康提供了新的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Han Y, He M, Marin T, Shen H, Wang WT, Lee TY, Hong HC, Jiang ZL, Garland T Jr, Shyy JY, Gongol B, Chien S. Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May 25;118(21):e2103982118. doi: 10.1073/pnas.2103982118. PMID: 34001623; PMCID: PMC8166073.

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