支原體qPCR法介紹：
熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。
優(yōu)點：
①靈敏度高、特異性強。
②時間短，2-3小時出結果
③檢測結果可定量
④操作簡便
缺點：
①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）
②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用。
操作步驟
第1步：樣本處理
a.細胞培養(yǎng)上清
b. 生物藥或需遵循藥典的樣本
說明：①樣品基質可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。
②細胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。
建議：樣本做DNA抽提處理，實現(xiàn)最高靈敏度。
推薦：德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒
Venor® Gem Sample Preparation Kit
該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗證。
第2步：試劑制備
a.凍干粉溶解
b. 反應體系制備
b1) 樣品為細胞上清篩查——反應體系制備
b2) 樣品為生物藥——反應體系制備
第3步：啟動熒光定量PCR儀
第4步：結果判別
FAM通道：檢測支原體熒光信號。HEX通道：檢測內控對照熒光信號。
支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。
支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低。
定量需基于Ct值和DNA標準曲線。
Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果
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