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科學(xué)培養(yǎng)指南——類器官

閱讀：3013      發(fā)布時(shí)間：2022-11-17
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類器官簡(jiǎn)介

類器官（Organoids）指利用成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞進(jìn)行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官，但能在結(jié)構(gòu)和功能上模擬真實(shí)器官，能夠模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及功能并能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

類器官的種類

類器官的發(fā)展史



早在 20 世紀(jì) 80 年代，“organoid"一詞就已經(jīng)提出, 1907年，美國(guó)貝克羅萊那大學(xué)教授威爾遜發(fā)現(xiàn)通過(guò)機(jī)械分離的海綿細(xì)胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的海綿有機(jī)體，是未來(lái)類器官技術(shù)發(fā)展的源頭。威爾遜的研究證明了成年的有機(jī)體在無(wú)需外界幫助、無(wú)需從特定的解剖學(xué)階段開(kāi)始，也具有完整的信息并可以成功發(fā)育成新的有機(jī)體。當(dāng)代類器官的發(fā)展成果，主要集中在近十余年。2009年，Hans Clevers實(shí)驗(yàn)室使用單個(gè)鼠LGR5+腸干細(xì)胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸類器官，開(kāi)啟了類器官發(fā)展的新篇章。

目前，多種臟器類器官已被成功構(gòu)建，其中包括小腸、胃、結(jié)腸、肺、膀胱、大腦、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、食道、心臟等，不僅包括正常器官組織類器官，還有相應(yīng)腫瘤組織類器官。近幾年涉及類器官研究的文獻(xiàn)數(shù)量呈直線上升趨勢(shì)，其中不乏多篇CNS等各大頂級(jí)期刊文獻(xiàn)。中國(guó)發(fā)表的類器官文獻(xiàn)數(shù)量在全球的排名從第六位（2009-2019年）躍至第二位（2020年），今次與美國(guó)。2021年，類器官被列為“十四五"國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)，隨著相關(guān)研究不斷深入，我國(guó)類器官技術(shù)水平將進(jìn)一步提升，同時(shí)在相關(guān)企業(yè)積極布局下，類器官市場(chǎng)化程度將不斷提升。


類器官研究發(fā)展進(jìn)程

類器官模型與其他模型比較



目前主要應(yīng)用臨床藥物篩選的模型主要分為2D細(xì)胞模型，3D類器官和人源性動(dòng)物移植模型（PDX）。其中腫瘤藥物篩選模型需要滿足在短時(shí)間內(nèi)出具藥敏檢測(cè)結(jié)果、藥物篩查通量高、預(yù)測(cè)效果準(zhǔn)確這三個(gè)方面，而類器官在這三方面對(duì)比其他藥篩方法都顯現(xiàn)出了強(qiáng)勁優(yōu)勢(shì)。

藥篩模型對(duì)比（來(lái)源：中國(guó)網(wǎng)醫(yī)療頻道）
特點(diǎn)2D細(xì)胞模型類器官PDX
生理變現(xiàn)局限性模型半生理模型生理模型
構(gòu)建時(shí)間短適中較長(zhǎng)
建模成功率高高低
藥物檢測(cè)通量很高高低
成本低適中高
樣本量要求少較小活檢/手術(shù)組織較大活檢/手術(shù)組織
血管化、免疫系統(tǒng)不具備不具備具備
操作難以程度容易容易困難
基因編輯容易容易困難
腫瘤異質(zhì)性難以實(shí)現(xiàn)可保留難以實(shí)現(xiàn)
臨床相關(guān)性低高高
生物庫(kù)建立可操作可操作難以實(shí)現(xiàn)

類器官模型的應(yīng)用



類器官培養(yǎng)

以小腸類器官培養(yǎng)為例操作方法：

實(shí)驗(yàn)材料

名稱

參數(shù)

注意

基質(zhì)膠

　

提前化凍

基礎(chǔ)培養(yǎng)基

B27 50x；N2  100x；N-Acetyl-L-cysteine1mM；Glutamax100x；HEPES  10mM ；Primocin500x；AdvancedDMEM/F12, ADMEM；細(xì)胞因子：Mouse-EGF（鼠源的表皮生長(zhǎng)因子）50ng/ml；HumanR-spondin1 500ng/ml；Mouse-noggin（BMP的抑制劑） 100ng/ml

培養(yǎng)基配置時(shí)一次不要太多，建議一次配20ml，配制好后用0.22um的濾器過(guò)濾（過(guò)濾的目的是除菌），置于4℃可保存4周。

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板

　

　

PBS

　

滅菌，預(yù)冷且加入雙抗


實(shí)驗(yàn)方法

隱窩分離及接板:

（1）解剖6-8周的小鼠，取胃以下約10cm的小腸，鑷子去腸系膜，剪刀沿腸道剪開(kāi)，用預(yù)冷的PBS洗3-5次，用載玻片小心的將小腸表面的絨毛刮去（顯微鏡下鏡檢），將刮好的小腸放入50ml離心管中，置于冰上；
（2）將小腸轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，用含雙抗的PBS清洗3-5次，將小腸轉(zhuǎn)移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min；
（3）將消化好的小腸轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中用含雙抗的PBS 清洗2次；
（4）加入25ml PBS適當(dāng)搖晃30-50下，取部分懸液鏡檢。懸浮液用70um的過(guò)濾篩過(guò)濾到新的50ml離心管中；
（5）重復(fù)步驟4，兩次收集的濾液800rpm 離心5min；
（6）棄上清，用2ml的ADMEM重懸沉淀，取適量的懸液計(jì)數(shù)；隱窩的數(shù)量控制在5-15個(gè)/ul 最佳；
（7）取適當(dāng)體積的懸液加入到1.5ml的離心管中，室溫下800rpm離心5min；
（8）棄上清，用預(yù)冷的基質(zhì)膠重懸（需充分混勻）；
（9）接板，24孔板接50ul的重懸液（注：基質(zhì)膠種在孔中間避免貼壁）；
（10）將接種好的板于培養(yǎng)箱中放置20-30min；
（11）每孔加500ul培養(yǎng)基，然后每隔2-3天換一次培養(yǎng)基，5-7天傳代一次。
注：所有的操作都要避免染菌，且組織需盡可能至于冰上。


小腸培養(yǎng)流程圖
類器官傳代:

（1）將傳代的隱窩冰上放置5-10min；
（2）小心吸出上清，并加入預(yù)冷的1ml 的ADMEM用大槍頭將基質(zhì)膠打碎，然后調(diào)制700ul量程，吹打30下左右，此過(guò)程避免產(chǎn)生氣泡?？扇∵m量的懸液觀察，直至看不到大塊的隱窩為止；
（3）將懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫800rpm離心 5min；
（4）后續(xù)接板步驟與隱窩接板步驟第8-11步一樣。
注：理論上傳一次可以擴(kuò)增3-5倍，但由于操作過(guò)程中的損失，因此一般只能擴(kuò)增3倍。

凍存及復(fù)蘇：

10%的DMSO，20%FBS，ADMEM補(bǔ)足，將懸液轉(zhuǎn)移至凍存管后，放入凍存盒中于-80℃冰箱中保存24h，若長(zhǎng)久保存，24h后需放入液氮罐中保存。復(fù)蘇參照復(fù)蘇細(xì)胞方法。

腫瘤類器官培養(yǎng)方法以腸癌為例：

實(shí)驗(yàn)材料

名稱

貨號(hào)

基質(zhì)膠

abs9495

Organotial結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

abs9445

試劑盒組成


組分

名稱

規(guī)格

保存

A組分

結(jié)直腸癌類器官緩沖液

100ml

4℃

B組分

結(jié)直腸癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

100ml

4℃

C組分

organo原代酶解液

25ml

4℃

D組分

organo消化液

25ml

4℃

E組分

organo原代酶終止液

100ml

4℃

F組分

組織保存液

100ml

4℃

G組分

organo凍存液

25ml

4℃

實(shí)驗(yàn)方法



1、原代
（1）將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃，拍照并登記信息。
（2）取樣瓶消毒，組織放入培養(yǎng)皿，結(jié)直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養(yǎng)皿中剪碎，大約1mm3的組織塊。
（3）癌組織用organo原代酶解液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過(guò)程中隨時(shí)觀察消化情況）加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。
（4）使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察，可以看到明顯的組織塊，將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清，重新重懸離心。
（5）去除上清，使用適量基質(zhì)膠（abs9495）進(jìn)行重懸(24孔板為例，每孔30ul）之后進(jìn)行鋪板（4℃下操作）拍照追蹤定位。
（6）將鋪好的板子放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加培養(yǎng)基B（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。


類器官培養(yǎng)流程（基質(zhì)膠法）
2、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液器吸去培養(yǎng)基，添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置5min。
（3）離心5min棄去液體，添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體或（添加適量消化液D作用90-120S終止，離心5min棄去混合液）。
（4）類器官收集后，添加適量類器官凍存液G，按500個(gè)/ml密度凍存（或進(jìn)行步驟5）。
（5）類器官收集后，基質(zhì)膠重懸，每孔30μl基質(zhì)膠鋪在24孔板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

3、類器官?gòu)?fù)蘇
（1）取10ml于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過(guò)程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)融解。
（4）將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 無(wú)菌離心管，使用移液管輕輕吹打3次，300g 離心 3分鐘，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量結(jié)直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質(zhì)膠重懸，每孔20μl基質(zhì)膠鋪在24控板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。


培養(yǎng)基培養(yǎng)腸癌類器官Day1-Day11的培養(yǎng)照

胃類器官


基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

EGF

Y-27623

N21

FGF-10

Gastrin

N-Acetylcysteine

Noggin

A 83-01

B27

R-Spondin 1

Nicotinamide

Penicillin/Streptomycin  

Wnt-3a

SB 202190

DMEM/F-12



GlutaminePlus



結(jié)腸類器官


基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

EGF

Y-27623

N21

FGF-10

A 83-01

N-Acetylcysteine

Noggin

Nicotinamide

B27

R-Spondin 1

SB 202190

Penicillin/Streptomycin  

Wnt-3a


DMEM/F-12



GlutaminePlus



腦類器官


基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

BDNF

Y-27623

N21

DKK1

Dorsomorphin

N-Acetylcysteine

EGF

GDC-0068

B27

FGF-basic

MK-2206

Penicillin/Streptomycin  

GDNF


DMEM/F-12

Noggin


GlutaminePlus



Insulin



2-mercaptoethanol



肺類器官


基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

Activin A

CHIR 99021

N21

FGF- basic

SB 431542

N-Acetylcysteine

Noggin


B27



Penicillin/Streptomycin  



DMEM/F-12



GlutaminePlus



肝類器官

基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

BMP-4

A 83-01

N21

EGF

DAPT

N-Acetylcysteine

FGF-10

Forskolin

B27

HGF

Nicotinamide

Penicillin/Streptomycin  

Noggin

PGE2

DMEM/F-12

R-Spondin 1

Y-27623

GlutaminePlus

Wnt-3a



FGF- basic



胰腺類器官

基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

EGF

A 83-01

N21

FGF-10

Gastrin

N-Acetylcysteine

Noggin

Nicotinamide

B27

R-Spondin 1


Penicillin/Streptomycin  

Wnt-3a


DMEM/F-12



GlutaminePlus



腎臟類器官


基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

Activin A

CHIR 99021

N21

BMP-2

Retinoic Acid

N-Acetylcysteine

BMP-4

Y-27623

B27

BMP-7


Penicillin/Streptomycin  

FGF-9


DMEM/F-12

FGF- basic


GlutaminePlus



前列腺類器官


基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

細(xì)胞因子

小分子化合物

N2

Activin A

A 83-01

N21

EGF

SB 202190

N-Acetylcysteine

FGF-10

Nicotinamide

B27

Noggin

CHIR 99021

Penicillin/Streptomycin  

R-Spondin 1

PGE2

DMEM/F-12

Wnt-10b

Testosterone

GlutaminePlus

FGF- basic


小分子化合物介紹


產(chǎn)品名稱

介紹

A 83-01

ALK4/ ALK5/ ALK7抑制劑

Retinoic Acid

維甲酸信號(hào)通路

CHIR 99021

GSK-3β抑制劑

DAPT

Notch通路抑制劑

Dorsomorphin

BMP和AMPK通路抑制劑

Forskolin

cAMP激活劑

Gastrin

胃泌素

Nicotinamide

Sirtuin去乙?；敢种苿?/span>

PGE2

前列腺素E2

SB 202190

p38 MAPK抑制劑

Y-27623

ROCK1抑制劑

小愛(ài)本期推薦



類器官培養(yǎng)基試劑盒

培養(yǎng)簡(jiǎn)單：培養(yǎng)基集成多種因子，無(wú)需添加其他因子和再優(yōu)化；

擴(kuò)增效率高：培養(yǎng)的類器官能夠快速增長(zhǎng)；

維持穩(wěn)定傳代：維持至少3代以上擴(kuò)增，部分類器官每次傳代可實(shí)現(xiàn)10代以上擴(kuò)增；

性價(jià)效益比：按照GMP級(jí)別生產(chǎn)條件下制備，批次質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯。

貨號(hào)

 品名

 規(guī)格

 abs9446

 Organotial乳腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit

 abs9448

 Organotial子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit

 abs9445

 Organotial結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit

 abs9444

 Organotial肝癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit

 abs9443

 Organotial肺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit

 abs9449

 Organotial胃癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit

 abs9447

 Organotial胰腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

 1kit


小分子化合物

貨號(hào)

品名

規(guī)格

abs812864

Y-27632

5mg

abs814916

Gastrin I (human)

5mg

abs817694

A-83-01

5mg

abs810052

CHIR-99021 (CT99021)

5mg

abs810473

DAPT

5mg

abs810530

Dorsomorphin free base

5mg

abs810050

Forskolin

5mg

abs816969

Nicotinamide

50mg

abs810009

SB202190 (FHPI)

5mg


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基質(zhì)膠

 貨號(hào)

 品名

 規(guī)格

 周期

abs9410

 即用型基質(zhì)膠

 100ml

 現(xiàn)貨

abs9490

 基質(zhì)膠（標(biāo)準(zhǔn)型、含酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9491

 基質(zhì)膠（標(biāo)準(zhǔn)型、無(wú)酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9492

 基質(zhì)膠（高濃度、含酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9493

 基質(zhì)膠（高濃度、無(wú)酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9494

 基質(zhì)膠（低因子、含酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9495

 基質(zhì)膠（低因子、無(wú)酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9496

 基質(zhì)膠（IPS驗(yàn)證無(wú)酚紅）

 1.5ml*4

 現(xiàn)貨

abs9497

 基質(zhì)膠（高濃度、低因子、含酚紅）

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨

abs9498

 基質(zhì)膠(高濃度，無(wú)酚紅，低生長(zhǎng)因子)

 1.5ml*8

 現(xiàn)貨


細(xì)胞因子

貨號(hào)

 品名

 規(guī)格

 abs04176

Recombinant Human Epidermal Growth Factor/EGF

50ug

 abs04695

Recombinant Human Noggin

50ug

 abs04398

Recombinant Human R-Spondin-1/RSPO1 (C-6His)

50ug

 abs04200

Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 2/FGF-2/FGFb (Pro143-Ser288)

50ug

 abs04227

Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 4/FGF-4

50ug

 abs04177

Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor I/IGF-I/IGF1

50ug

 abs04228

Recombinant Human Fibroblast growth factor 10/FGF10

50ug

 abs00939

Recombinant Human BMP-4

10ug

 abs04174

Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2/BMP-2

50ug

 abs04196

Recombinant Human/Mouse Activin A/INHBA

50ug

 abs04355

Recombinant Human Dickkopf-Related Protein 1/DKK1 (N-8His)

50ug


參考文獻(xiàn)：

[1] CORNING. Using Organoids for Disease Modeling. Nov. 11, 2019.

[2] Lee, J. et al. Nat Commun 11, 4283 (2020).

[3] SCIENCING. Types of Sea Sponges. 2019.

[4] Wilson, H. V. Development of sponges from dissociated tissue cells.

[5] Sato, T. et al. Nature 459, 262–265 (2009).

[6] Corrò C et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.


Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

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