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siRNA轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)操作流程
以下是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的 siRNA轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)操作流程，整合了關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化與避坑指南，適用于絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系（貼壁/懸?。?，分為 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作步驟、質(zhì)控要點(diǎn)三部分：
一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)關(guān)鍵點(diǎn)（轉(zhuǎn)染前必看）
要素 | 推薦方案 | 避坑提示 |
siRNA濃度 | 終濃度10-50nM（預(yù)實(shí)驗(yàn)梯度測(cè)試） | ＞100nM易致脫靶效應(yīng) |
細(xì)胞密度 | 貼壁細(xì)胞：30-50%匯合度 | 過(guò)密→毒性↑；過(guò)低→效率↓ |
轉(zhuǎn)染試劑 | Lipofectamine™ RNAiMAX（通用） | 避免含血清培養(yǎng)基稀釋試劑 |
對(duì)照設(shè)置 | - 陰性對(duì)照：Scrambled siRNA | 缺一不可！ |
二、標(biāo)準(zhǔn)操作流程（以24孔板為例）
Day 0：細(xì)胞鋪板
1. 消化細(xì)胞 → 用wanquan培養(yǎng)基 調(diào)整密度 → 每孔接種 0.5mL（貼壁細(xì)胞數(shù)：5-8×10?；懸浮細(xì)胞數(shù)：2×10?）
2. 37℃培養(yǎng)箱放置 16-24h（目標(biāo)：轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度≈40%）
關(guān)鍵細(xì)節(jié)：
- siRNA工作液濃度 = 儲(chǔ)存濃度×30（例：20μM儲(chǔ)存液→工作液終濃度≈33nM）
- 轉(zhuǎn)染試劑用量參考說(shuō)明書(shū)（RNAiMAX通常 試劑:siRNA體積比=1:1）
Day 2：換液與檢測(cè)
1. 轉(zhuǎn)染后 6h 更換wanquan培養(yǎng)基（高毒性細(xì)胞如原代神經(jīng)元需4h內(nèi)換液）
2. 繼續(xù)培養(yǎng) 24-72h（基因沉默峰值時(shí)間需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）
三、質(zhì)控關(guān)鍵步驟（決定成敗?。?/span>
1. 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證（必做）
- 方案1：轉(zhuǎn)染 FAM標(biāo)記siRNA → 24h后熒光顯微鏡觀察（效率＞80%合格）
- 方案2：共轉(zhuǎn)染 EGFP質(zhì)粒 → 計(jì)算綠色細(xì)胞占比（成本低但間接）
2. 沉默效果檢測(cè)
3. 細(xì)胞毒性評(píng)估
- MTT法：轉(zhuǎn)染后24h檢測(cè)，存活率應(yīng)＞85%
- 形態(tài)觀察：懸浮細(xì)胞聚團(tuán)、貼壁細(xì)胞空泡化→提示毒性過(guò)強(qiáng)
四、高頻問(wèn)題解決方案
問(wèn)題 | 原因 | 優(yōu)化方案 |
效率低 | siRNA降解/試劑失效 | 新解凍siRNA；更換轉(zhuǎn)染試劑批次 |
細(xì)胞死亡率高 | 復(fù)合物局部濃度過(guò)高 | 轉(zhuǎn)染前混勻培養(yǎng)基；懸浮細(xì)胞用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法 |
沉默效果不穩(wěn)定 | 基因半衰期長(zhǎng) | 延長(zhǎng)檢測(cè)至72h；轉(zhuǎn)染兩次（間隔24h） |
脫靶效應(yīng) | siRNA種子區(qū)匹配非靶基因 | 更換siRNA序列；使用化學(xué)修飾siRNA（如Stealth™） |
五、特殊細(xì)胞優(yōu)化方案
1. 原代細(xì)胞：
- 轉(zhuǎn)染試劑：選 DharmaFECT™ Primary 或 jetPRIME®
- 方案：轉(zhuǎn)染前饑餓處理2h（無(wú)血清培養(yǎng)基）→ 復(fù)合物孵育時(shí)間縮短至5min
2. 懸浮細(xì)胞：
- 試劑：Neofect™ DNA/RNA Transfection Reagent
- 步驟：離心收集細(xì)胞 → 重懸于復(fù)合物 → 24孔板每孔接種500μL（密度5×10?/mL）
3. 難轉(zhuǎn)細(xì)胞（如神經(jīng)元）：
- 專(zhuān)用試劑：NeuroFect™（佐劑提高穿透性）
- 轉(zhuǎn)染后不換液 → 直接補(bǔ)等體積wanquan培養(yǎng)基
六、試劑耗材推薦表
類(lèi)型 | 推薦產(chǎn)品 | 適用場(chǎng)景 |
通用轉(zhuǎn)染試劑 | Lipofectamine™ RNAiMAX | 293T/HeLa等常見(jiàn)細(xì)胞 |
難轉(zhuǎn)細(xì)胞試劑 | jetPRIME® | 原代/干細(xì)胞/懸浮細(xì)胞 |
陽(yáng)性對(duì)照siRNA | Silencer™ GAPDH siRNA | 體系驗(yàn)證 |
陰性對(duì)照 | AllStars Neg. siRNA | 排除非特異效應(yīng) |
> 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：合格實(shí)驗(yàn)需滿足——轉(zhuǎn)染效率＞80% + 沉默效率＞70% + 細(xì)胞存活＞85%
避雷總結(jié)：
1. 勿用含抗生素或血清的培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物（滅活試劑）
2. 轉(zhuǎn)染后換液時(shí)間寧早勿晚（超8h毒性飆升）
3. 凍存siRNA避免反復(fù)凍融＞3次（分裝儲(chǔ)存-80℃）
按照此流程操作，可穩(wěn)定獲得可重復(fù)的基因沉默數(shù)據(jù)！
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