泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是一種高度調(diào)控的機制，通過蛋白質(zhì)的泛素化和降解來控制許多細胞過程。泛素通過其C末端與目標蛋白上的賴氨酸殘基結合，可以以單體形式或聚合鏈形式存在。泛素鏈可以通過泛素的第一個甲硫氨酸（M1）形成線性鏈，也可以通過其七個賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）形成特定賴氨酸鏈。K48和K63連接的泛素鏈是細胞中最為主要的多泛素化形式。

泛素化是一個可逆的過程，去泛素化酶（DUBs）可以去除目標蛋白上的泛素，從而拯救它們免于蛋白酶體降解。確定目標蛋白上的多泛素化程度和類型對于理解它們在正常細胞過程以及與UPS相關疾病狀態(tài)中的泛素介導調(diào)控至關重要。傳統(tǒng)上，這些過程是通過質(zhì)譜分析或使用抗泛素抗體進行免疫沉淀后，再進行免疫印跡來監(jiān)測的。然而，在免疫印跡步驟中，由于表位掩蓋、親和力降低或蛋白質(zhì)多泛素化導致的選擇性變化，底物抗體常常與底物的多泛素化形式產(chǎn)生不同的相互作用。

圖1：UbiTest檢測的示意圖：通過磁性TUBEs捕獲富集泛素化蛋白，然后從TUBEs中洗脫。分離的多泛素化洗脫液被分成兩部分：一部分保持未處理狀態(tài)，而第二部分用廣譜去泛素化酶（DUB）消化以去除泛素鏈。兩部分均使用針對目標蛋白（POI）的抗體進行免疫印跡分析。從多泛素化POI上去除泛素鏈后，在免疫印跡中可以看到一個單一的、未修飾的POI條帶。

一種更明確的證明蛋白質(zhì)泛素化的方法是，在免疫印跡分析之前，將免疫沉淀與使用廣譜去泛素化酶（DUB）進行去泛素化相結合。如果在經(jīng)過DUB處理后，目標蛋白（POI）的信號增強，這表明該蛋白即使在未處理的樣本中沒有明顯的反應性，也已經(jīng)發(fā)生了泛素化。

LifeSensors的UbiTest檢測利用TUBEs（串聯(lián)泛素結合實體）來捕獲多泛素化蛋白，以避免由于POI免疫反應性變化而可能出現(xiàn)的問題。TUBEs是經(jīng)過工程改造的串聯(lián)泛素結合結構域，其與多泛素的解離常數(shù)在納摩爾范圍內(nèi)。LifeSensors的泛選擇性TUBEs已被證明能夠結合所有八種泛素連接類型。

為了確定目標蛋白上多泛素化的連接類型，LifeSensors開發(fā)了一種更具針對性的方法，該方法在免疫印跡分析之前使用特定連接類型的DUB。如果在經(jīng)過K48/K63特異性DUB處理后，與未修飾POI對應的條帶信號增強，則表明該蛋白發(fā)生了K48/K63多泛素化。

艾美捷UbiTest緩沖液（#LSS-UM-0411-3000）相關產(chǎn)品：

UE103：UbiQuant S試劑盒  

UE905：UbiQuant Ultra微孔板  

UM413：K63連接特異性UbiTest試劑盒——瓊脂糖TUBE洗脫試劑盒  

UM201-1MG：抗泛素TUBE 1，His6  

UM102：TUBE 2（GST）