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ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。在檢測(cè)時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體，通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

ELISA實(shí)驗(yàn)中顯色淡或顯色偏低可能由多種原因造成，解決這一問題需要細(xì)致的實(shí)驗(yàn)操作和對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的精確控制。以下是一些常見的原因及其對(duì)應(yīng)的解決攻略：

1. 溫育時(shí)間不夠或溫度不正確

- 原因：抗原抗體反應(yīng)需要足夠的時(shí)間達(dá)到反應(yīng)高峰，溫育時(shí)間過短或溫度未達(dá)到37°C，會(huì)影響顯色。

- 解決方案：嚴(yán)格按照說明書要求，確保溫育時(shí)間充足，溫育箱溫度穩(wěn)定在37±0.5°C，避免頻繁開關(guān)溫育箱門。

2. 加樣量不足或操作不當(dāng)

- 原因：加樣量不足、移液時(shí)有氣泡或吸頭殘留液體過多，導(dǎo)致反應(yīng)物濃度不足。

- 解決方案：使用校準(zhǔn)的移液器，確保移液器與吸頭匹配，移液不宜過快，排放要全，避免氣泡。

3. 試劑和樣品未平衡至室溫

- 原因：低溫試劑直接使用會(huì)影響反應(yīng)效率。

- 解決方案：從低溫保存條件取出的試劑和樣品需在室溫平衡30分鐘以上再使用。

4. 檢測(cè)抗體或酶濃度過低

- 原因：檢抗或酶濃度過低，不足以催化足夠的顯色反應(yīng)。

- 解決方案：按照說明書準(zhǔn)確配比高濃縮試劑，確保檢抗和酶的濃度符合要求。

5. 標(biāo)準(zhǔn)品溶解不充分

- 原因：凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解不均或未充分混勻，影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性。

- 解決方案：先進(jìn)行離心，避免試劑粘附于管蓋或管壁，加入足量稀釋液，充分混勻，可靜止一段時(shí)間再反復(fù)吹打但避免起泡。

6. 洗板操作不當(dāng)

- 原因：不正確的洗板或過度洗板會(huì)去除結(jié)合在孔壁上的抗原-抗體復(fù)合物，導(dǎo)致顯色降低。

- 解決方案：按操作要求進(jìn)行洗板，避免過度洗板，對(duì)于敏感指標(biāo)尤其注意。

7. 顯色時(shí)間不足

- 原因：顯色時(shí)間過短，梯度顯色未全形成。

- 解決方案：每隔10分鐘觀察，待有梯度顯色時(shí)加入終止液終止顯色。

8. 酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤

- 原因：酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)設(shè)置不正確，影響讀數(shù)準(zhǔn)確性。

- 解決方案：使用正確的濾光片，酶標(biāo)儀每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行一次校準(zhǔn)。

9. 試劑盒過期或保存不當(dāng)

- 原因：過期或保存條件不當(dāng)?shù)脑噭┖锌赡軐?dǎo)致酶活性下降。

- 解決方案：確保使用在有效期內(nèi)的試劑盒，按照說明書要求保存試劑盒。

10. 樣本中目標(biāo)蛋白表達(dá)量低

- 原因：樣本中目標(biāo)蛋白含量低，不足以產(chǎn)生顯著的顯色反應(yīng)。

- 解決方案：如果標(biāo)準(zhǔn)曲線正常，檢查樣本中目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，必要時(shí)稀釋樣本或增加樣本量。

11. 抗體非特異性結(jié)合

- 原因：封閉不充分或封閉液選擇不當(dāng)導(dǎo)致背景高。

- 解決方案：確保進(jìn)行了適當(dāng)?shù)姆忾]處理，使用5-10%的與二抗同種動(dòng)物來源的血清或牛血清作為封閉液。

12. 洗滌緩沖液?jiǎn)栴}

- 原因：洗滌不充分或省略了洗滌步驟，導(dǎo)致背景色過高。

- 解決方案：檢查并確保完成所有的洗滌步驟，確保洗滌緩沖液的正確稀釋和使用。

13. 底物污染

- 原因：底物在使用前被污染，導(dǎo)致顯色不均。

- 解決方案：確保底物在使用前保存在避光條件，避免金屬離子或氧化劑污染。

14. 樣本處理不當(dāng)

- 原因：樣本處理過程中可能引入干擾因素，如溶血、細(xì)菌污染等。

- 解決方案：避免樣本溶血，確保無菌操作，使用抗凝劑時(shí)注意說明書要求。

通過上述措施的綜合應(yīng)用，可以有效解決ELISA實(shí)驗(yàn)中顯色淡的問題，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。