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注意微生物污染

一年

1. 離心機(jī)
2. 移液器3. 冰箱

1. PBS
2. 消化液
3. 培養(yǎng)液和不培養(yǎng)液

1. 注意無菌操作，盡量避免污染。
2. 使用高純度DNA或RNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。DNA不應(yīng)含有蛋白和酚。
3. 為了取得較高的轉(zhuǎn)染效率，推薦使用在50代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)。
4. 高純度的質(zhì)粒是獲得高轉(zhuǎn)染效率的必要條件，要確保OD260/OD280≥1.8.
5. 該轉(zhuǎn)染試劑不應(yīng)渦旋或離心，宜緩慢晃動混勻。
6. 在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染試劑：DNA（ug）=2:1~6:1之間選擇比例。
7. 影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，如細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)及密度、DNA/siRNA轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染試劑與DNA/siRNA比例等，應(yīng)再具體實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件。

DNA轉(zhuǎn)染（以12孔板為例）：
1. 在轉(zhuǎn)染前18~24h用消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的12孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞密度大70～90%滿時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按12孔板計(jì)算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，請按比例自行調(diào)節(jié)用量。
2. 在加入待轉(zhuǎn)染的DNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的培養(yǎng)液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養(yǎng)液，但抗生素使某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性。
3. 配制染色工作液：取2個無菌離心管，分別加入50ul不含抗生素和血清的培養(yǎng)液，取其中一離心管加入1.6~3ugDNA，輕輕混勻；取另一離心管加入4ul脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。室溫靜置5min，將含有DNA的培養(yǎng)液用微量移液器輕輕加入含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置20min。
4. 將上述轉(zhuǎn)染工作液逐滴滴入對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng)。
5. 培養(yǎng)4~6h后，更換為含有血清的培養(yǎng)液。對于Hela細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染4h更換培養(yǎng)液；對于NIH3T3、 CHO、 HEK293T和 HEK293FT 細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染6h更換培養(yǎng)液。
繼續(xù)培養(yǎng)24~48h后，觀察或收集細(xì)胞或加入適當(dāng)?shù)暮Y選藥物如G418等進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。

（二）siRNA轉(zhuǎn)染（以12孔板為例）：
1. 在轉(zhuǎn)染前18~24h用消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的12孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞密度大50～80%滿時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按12孔板計(jì)算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，請按比例自行調(diào)節(jié)用量。
2. 在加入待轉(zhuǎn)染的siRNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的培養(yǎng)液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養(yǎng)液，但抗生素使某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性。
3. 配制染色工作液：取2個無菌離心管，分別加入50ul不含抗生素和血清的培養(yǎng)液，取其中一離心管加入40pmol siRNA，輕輕混勻；取另一離心管加入2ul轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。室溫靜置5min，將含有siRNA的培養(yǎng)液用微量移液器輕輕加入含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置20min。
4. 將上述轉(zhuǎn)染工作液逐滴滴入對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng)。
5. 培養(yǎng)4~6h后，更換為含有血清的培養(yǎng)液。對于Hela細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染4h更換培養(yǎng)液；對于NIH3T3、 CHO、 HEK293T和 HEK293FT 細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染6h更換培養(yǎng)液。
6. 繼續(xù)培養(yǎng)24~48h后，觀察或收集細(xì)胞。