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說(shuō)一說(shuō)熒光素酶的作用原理
閱讀：2517 發(fā)布時(shí)間：2022-4-20
熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光。然后可以通過(guò)熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。
目前，具有代表性的是從甲蟲(chóng)中分離得到的螢火蟲(chóng)熒光素酶（Fireflyluciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renillaluciferase）。其中螢火蟲(chóng)熒光素酶作為報(bào)告基因反應(yīng)目的基因表達(dá)的改變，腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，為實(shí)驗(yàn)提供統(tǒng)一基準(zhǔn)線（減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響）。
螢火蟲(chóng)熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生黃綠色光，波長(zhǎng)540-600nm。
腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)460-540nm，一般檢測(cè)時(shí)選用460nm
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。
由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)內(nèi)源性表達(dá)，使其雙報(bào)告基因系統(tǒng)在基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。