（1）試劑：MatrigengeL Matrix、小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒、類器官消化液、潤洗液、基礎培養(yǎng)基。

（2）耗材：48孔細胞培養(yǎng)板、離心管（規(guī)格為1.5mL）、移液器（規(guī)格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規(guī)格為10μL、200μL和1000μL）、40μm細胞過濾器。

（1）MatrigengeL Matrix 4℃化凍

（2）小鼠膽管類器官培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement C(250x)加至9.76mL Mouse Liver Ductal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠膽管類器官培養(yǎng)基，室溫平衡，可在2-8°C儲存，建議在兩周內使用。

以下操作吹打細胞的吸頭均需用潤洗液潤洗后使用：

（1）小鼠膽管類器官收集：保留原有培養(yǎng)液，用移液管吸頭輕輕刮下吹打細胞外基質和小鼠膽管類器官混合物，轉移至1.5mL離心管中，吹打5~10次，使小鼠膽管類器官和細胞外基質分離，300g離心3分鐘。

（2）小鼠膽管類器官消化：離心后，去除上清液，分別加入200μL類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化。

（3）小鼠膽管類器官終止消化：類器官消化時間5分鐘，吹打混勻，加入1mL基礎培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應，300g離心3分鐘。

（4）細胞過濾：加入1mL基礎培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，用40μm細胞篩網(wǎng)過濾細胞懸液，收集濾液至新的離心管中，300g離心3分鐘。

（5）小鼠膽管類器官清洗：離心后用基礎培養(yǎng)基清洗1次收集至同一個離心管中，離心以去除殘留的消化液。

（6）細胞計數(shù)：用1mL基礎培養(yǎng)基重懸細胞，取18μL細胞懸液與2μL臺盼藍混勻，取10μL混合液加至血球計數(shù)板中，顯微鏡下觀察計數(shù),300g離心3分鐘，棄上清。

（7）基質膠3D包裹：根據(jù)密度加入適量基礎培養(yǎng)基重懸細胞，取5 μL細胞懸液至新的離心管中，每組分別與18μL不同的細胞外基質冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內），混勻后置于冰上。

（8）種板培養(yǎng)：用移液器吸取10μL細胞外基質和細胞的混合液移至培養(yǎng)板孔中，混合懸液須點在培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側壁，平行2孔。將培養(yǎng)板放入37℃，在5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中孵育20分鐘，待細胞外基質凝固至不再流動后，沿孔壁緩緩加入250μL培養(yǎng)基。

（9）持續(xù)培養(yǎng)：將細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察小鼠膽管類器官的生長狀態(tài)，于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個視野中類器官的形態(tài)和分布。

?；|膠與Brand C基質膠均有良好的培養(yǎng)效果，兩組實驗膽管類器官均無明顯貼壁現(xiàn)象，其中20224105CWD的培養(yǎng)效果會好一些。

?；锘|膠經(jīng)過嚴格的質檢驗證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩(wěn)定性好、低內毒素、無污染。在購買?；a(chǎn)品時，根據(jù)用戶個性化的需求對用戶進行最佳產(chǎn)品、貨號的推薦。

1.Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver（science）