Pure 制備色譜
在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用
Pure 應(yīng)用
"
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簡(jiǎn)介
反向柱層析法（Reverse Phase Column Chromatography, RPCC）是天然產(chǎn)物分離的重要手段之一，其核心作用是通過極性差異實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物中目標(biāo)成分的純化，固定相為非極性（C18、C8 鍵合硅膠），流動(dòng)相為極性溶劑（水、甲醇、乙腈等）。極性越弱的成分與固定相作用越強(qiáng)，洗脫越慢，從而實(shí)現(xiàn)分離。
本實(shí)驗(yàn)通過制備型快速柱層析技術(shù)將正相柱層析組分按照極性大小洗脫，流動(dòng)相為甲醇、水，極性大的組分先被洗脫下來，極性小的組分后被洗脫下來，將洗脫下來的組分減壓旋干稱重，利用高效液相色譜查看分離效果。
▲ 圖1：Buchi Pure C-810 純化分離系統(tǒng)
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實(shí)驗(yàn)
2.1 設(shè)備
Buchi Pure C-810 純化分離系統(tǒng)
BUCHI Rotavapor R-300
真空恒溫干燥箱
保干器
高效液相色譜
2.2 試劑及耗材
色譜柱 4g
1mL 一次性塑料注射器
500mL 圓底燒瓶
研缽
試劑（分析純）: 甲醇、水
2.3 樣品和準(zhǔn)備工作
樣品：正相柱層析的組分 G-12
將 G-12 保干后稱重得質(zhì)量 m=2.5775g，將該組分全部溶于甲醇（分析級(jí)）后倒入研缽中，加入該組分質(zhì)量 0.8 倍的 C-18 填料拌樣，拌干后裝入柱子中，又下至上按照 C-18 硅膠、樣品、保護(hù)硅膠填滿整根柱子。
2.4 實(shí)驗(yàn)過程
極性組分分離過程包括快速分離制備色譜柱的活化、極性組分的分離、濃縮和稱重。
2.4.1 色譜柱的活化
取一支色譜柱 4g 安裝在 Pure C-810 上，連接好溶劑、管路， 按照 表1 參數(shù)平衡色譜柱，充分活化。
表 1：色譜柱平衡參數(shù)
Equilibration time | 10min | |
Flow rate | 15mL/min | |
Methanol % | 20 | |
Water % | 80 | |
表 2：極性組分分離參數(shù)及洗脫梯度
參數(shù)表 | ||
Solvent A | Methanol | |
Solvent B | Water | |
Flow rate | 15mL/min | |
UV length 1 | 254nm | |
UV length 2 | 210nm | |
UV length 3 | 280nm | |
UV length 4 | 320nm | |
UV sensitivity | low | |
UV threshold | 0.05AU | |
Collection | No Collection | |
梯度表 | ||
Time/min | Solvent | %2nd |
0 | AB | 80 |
25 | AB | 80 |
0 | AB | 60 |
35 | AB | 60 |
0 | AB | 40 |
50 | AB | 40 |
0 | AB | 30 |
80 | AB | 30 |
0 | AB | 20 |
70 | AB | 20 |
0 | AB | 10 |
54 | AB | 10 |
0 | AB | 0 |
60 | AB | 0 |
2.4.2 極性組分的收集與濃縮
以 500mL 收集瓶為收集容器外置在一側(cè)，從洗脫開始收集洗脫液。如 圖2 所示：
▲ 圖2：安裝色譜柱，極性組分洗脫液的收集及操作界面
取干凈的 500mL 圓底燒瓶烘干，根據(jù)色譜分離圖譜將收集到的極性洗脫液轉(zhuǎn)入燒瓶中，旋蒸除去溶劑，將樣品轉(zhuǎn)移至西林瓶中，按照相同步驟收集濃縮相應(yīng)極性組分，將所有組分吹干后放入保干器中干燥24h后稱重。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，通過紫外檢測(cè)器我們可以觀察到樣品的出峰情況，可以根據(jù)此情況調(diào)整洗脫時(shí)間，盡可能的提高效率。
3
結(jié)果
3.1 G-12 的極性組分分離圖譜
▲ 圖 3：G-12 極性組分分離圖譜
3.2 G-12 極性組分含量
樣品名稱 | m [mg] | |
G-12-1 | 1211.8 | |
G-12-2 | 108.8 | |
G-12-3 | 196.3 | |
G-12-4 | 248.0 | |
G-12-5 | 380.3 | |
G-12-6 | 139.8 | |
G-12-7 | 42.1 | |
各極性組分質(zhì)量和與 G-12 樣品質(zhì)量相比并未有太大差距，證明利用此法樣品損耗量小。
3.3 分離效果高效液相色譜驗(yàn)證
將濃縮后的組分溶于適量色譜甲醇中，高效液相色譜分析條件為 20-95 甲醇 25min，100甲醇 10min，分離效果如 圖5 所示，結(jié)果表明各極性組分分離效果良好，并且將前 5min 的大峰單獨(dú)分離出來后，后 20min 的小峰均顯現(xiàn)出來，有助于分離單體化合物。
圖 5：極性組分高效液相色譜圖
▲ G-12 組分分析圖
▲ G-12-1 組分分析圖（20%甲醇）
▲ G-12-2 組分分析圖（40%甲醇）
▲ G-12-3 組分分析圖（60%甲醇）
▲ G-12-4 組分分析圖（70%甲醇）
▲ G-12-5 組分分析圖（80%甲醇）
▲ G-12-6 組分分析圖（90%甲醇）
▲ G-12-7 組分分析圖（100%甲醇）
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結(jié)論
本應(yīng)用用 BUCHI 制備型色譜儀 Pure C-810 對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物正相柱層析組分按極性進(jìn)行分離，分離色譜圖表明該組分分離效果良好，組分損耗較少，且通過高效液相色譜驗(yàn)證，許多原本看不到的小峰在進(jìn)行砍段后可以顯現(xiàn)，證明此法的可行性。
5
參考文獻(xiàn)
Operation manual of Pure C-810
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