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PCR反應(yīng)條件和特點
（1）標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：
10X緩沖液：10 μL
4種dNTP混合物：各200umol/L
引物：各10～100pmol
模板DNA：0.1～2μg
Taq DNA聚合酶：2.5U
Mg2+ ：1.5mmol/L
（2）PCR反應(yīng)過程：
（3）PCR反應(yīng)特點：
靈敏度高
皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平
能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞
病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU
細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌
簡便、快速
一次性加好反應(yīng)液，2～4 小時完成擴(kuò)增
擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析
對標(biāo)本的純度要求低
血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA
PCR反應(yīng)體系
以DNA為模板的反應(yīng)
反應(yīng)體積：50~100μl
緩沖液
引物
底物：4種dNTP
模板：102~105拷貝
TaqDNA聚合酶
礦物油
以mRNA為模板的反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄PCR）
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
體積：20 μl
緩沖液
底物：4種dNTP
引物：oligo(dT)12~18
模板：RNA
逆轉(zhuǎn)錄酶
其他試劑：RNA酶抑制劑，
MgCl2.DTT.牛血清白蛋白
PCR反應(yīng)體系同以DNA模板的反應(yīng)體系
（一）PCR反應(yīng)成分
1、模板
單、雙鏈DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。
一般100ng DNA模板/100mL。
模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。
2、引物濃度
0.1-0.5 mmol/L
濃度過低影響產(chǎn)量，偏高引起錯配和非特異性產(chǎn)物增加，且可增加引物二聚體的產(chǎn)生幾率。
3、Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
0.5-2.5 U/50 ml
酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。
4、dNTP 20~200μmol/L
dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度
四種dNTP濃度應(yīng)相等
濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量，但特異性增加
dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。
5、 Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。
Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。
Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。
6、 PCR反應(yīng)的緩沖液
10~50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72℃ 時pH 7.2,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50 mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級結(jié)構(gòu)。
（二）循環(huán)參數(shù)
1、變性
94oC~95oC，30-60 s
且最初在加Taq酶之前先于97oC充分變性5~10min
2、退火
50oC~55oC，60-90 s
增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;
降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。
3、延伸
70oC~74oC，60-120 s
延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定
4、循環(huán)次數(shù)
主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次
次數(shù)過多：非特異擴(kuò)增增加
（三）PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律
在PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)"，又稱“平臺期"。到達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等因素。到達(dá)平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)。
多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應(yīng)中不可避免。
PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖
