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澳大利亞Panbio公司一直在登革熱（Dengue fever）、羅斯河熱（Ross river fever）的診斷試劑產(chǎn)品方面保持著市場(chǎng)地位。公司的西尼羅河腦炎（West Nile encephalopalitis）診斷試劑在家獲得美國(guó)FDA注冊(cè)。Panbio登革產(chǎn)品擁有廣的產(chǎn)品系列，有著的應(yīng)用。

產(chǎn)品規(guī)格：25T/盒

TEL:⒈⒊⒎⒈0.0.0⒎⒈⒈⒎

登革熱IgM（捕獲法）ELISA檢測(cè)試劑盒Panbio

應(yīng)用范圍

DENV Detect IgM Capture ELISA是一種用來(lái)檢測(cè)人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，它可以檢測(cè)出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗原（DENVRA）的IgM抗 體?？偞砣A南生物工程有限公司。此診斷實(shí)驗(yàn)用于有登革熱發(fā)熱或是登革熱血熱臨床癥狀的病人檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果必須經(jīng)過(guò)蝕斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）或是根據(jù)CDC疾病診斷指南確證。

用于臍帶血檢測(cè)，新生兒測(cè)試，產(chǎn).前.篩查，或是普通人群篩查的實(shí)驗(yàn)特征性能還未建立。此試驗(yàn)未經(jīng)FDA明確證明可用于血液或血漿捐獻(xiàn)者的檢測(cè)。

注意：試驗(yàn)中需觀察西尼羅河或是其他病毒中的IgM是否會(huì)與登革熱試劑盒發(fā)生交叉反應(yīng)，如可能發(fā)生了交叉反應(yīng)，則視為警告狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)原理

DENV Detect IgM ELISA試劑盒是由一種酶聯(lián)擴(kuò)大的兩步法免疫檢測(cè)系統(tǒng)。在此實(shí)驗(yàn)中，將登革熱陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控和未知濃度的血清樣品用樣品稀釋液稀釋?zhuān)缓蠹尤氲桨?了抗人IgM抗體的微孔中溫育，之后分別加入登革熱源性重組抗原DENVRA和正常細(xì)胞抗原（NCA）進(jìn)行溫育。總代理華南生物工程有限公司。溫育并洗板后，用HRP標(biāo)記的DEN特異 性抗體處理。第二次溫育并洗板后，加入TMB底物液進(jìn)行溫育。之后再加入酸性終止液，450nm處測(cè)OD值可確定底物反應(yīng)的程度。當(dāng)高于一定數(shù)值時(shí)（臨界 值），樣品的吸光度值可確定樣品中是否存在登革熱抗體。

注意：陰性質(zhì)控和弱陽(yáng)性質(zhì)控以?xún)?nèi)在質(zhì)控形式提供，其目的是為了監(jiān)測(cè)試劑盒成分的完整性。

試劑盒成分

登革熱IgM ELISA試劑盒提供了足夠做96個(gè)測(cè)試所需要的試劑。試劑盒成分如下：

登革熱檢測(cè)特定材料：

1）抗人IgM包被的包被板：帶板蓋的板架，包被有抗人IgM， 96孔，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

2）樣品稀釋液：1瓶，25ml，即用，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin防腐劑和添加劑，用于試驗(yàn)樣品，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控的稀釋?zhuān)?-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定

3）即用型的登革熱重組性抗原（DENRA）：1瓶，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，抗生素（0.0025-0.004% G418 硫酸鹽），登革熱重組抗原和添加劑， 2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

4）即用型正常細(xì)胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，COS-1細(xì)胞的上清， 2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

5）登革熱陰性質(zhì)控：1支，50ul陰性血清，登革熱陰性質(zhì)控可輔助監(jiān)測(cè)試劑盒的完整性。2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

6）登革熱IgM陽(yáng)性質(zhì)控：1支，50ul含0.03%的proclin的陽(yáng)性血清，登革熱陽(yáng)性質(zhì)控可輔助監(jiān)測(cè)試劑盒的完整性。2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

7）10倍濃縮洗滌液：1瓶，120ml，含吐溫20的10倍濃縮的磷酸緩沖鹽，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

8）HRP標(biāo)記的即用型酶聯(lián)物，1瓶，6ml，HRP標(biāo)記的黃熱病毒活性單克隆抗體，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.01%的硫柳汞防腐劑和添加劑，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

9）Enwash：1瓶，20ml，即用，含吐溫20的磷酸緩沖鹽， 2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定

10） TMB底物液：1瓶，9ml液態(tài)底物液，即用，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。注意：底物液必須始終儲(chǔ)存于避光試劑瓶中。

11） 終止液：1瓶，內(nèi)含6ml即用型的終止液，1N的硫酸，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。注意：強(qiáng)酸，請(qǐng)戴保護(hù)手套、口罩和安全鏡，按照安全條例處理所有的材料。

實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供

1）可在450nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀

2）生物學(xué)或高純度水

3）真空泵

4）洗板機(jī)

5）37℃無(wú)CO2的孵箱

6）1-10ul的單道移液器，50-200ul的單道和多道移液器。

7）聚丙烯試管

8）Parafilm封口膜

9）計(jì)時(shí)器

10） 旋渦混合器

樣品的采集與準(zhǔn)備

1）此實(shí)驗(yàn)必須用血清來(lái)做。全血和血漿樣本不能直接檢測(cè)。

2）不要將不同批次的試劑混亂

3）不要加熱熱滅活的試驗(yàn)血清

4）實(shí)驗(yàn)前將所有試劑平衡至室溫，溫度的改變會(huì)對(duì)試驗(yàn)有影響

5）避免反復(fù)凍融樣品血清

6）直接用干凈的槍頭從試劑瓶中移去試劑，不能轉(zhuǎn)移，避免污染

7）不用的板條應(yīng)立即放回至密封袋中保存

8）不要使用任何過(guò)期的試劑

9）避免試劑暴露受熱或陽(yáng)光直射

10） 有些試劑可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前一定要混勻

11） 洗滌過(guò)程不完整會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響

12） 為了減少由于孵育時(shí)間的差異而引起的漂移，建議底物液和終止液加入的時(shí)間和速度要*

13） 避免試劑中有微生物污染，尤其是酶聯(lián)物

14） 每一次吸取試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品時(shí)都應(yīng)用干凈的槍頭

實(shí)驗(yàn)步驟

將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實(shí)驗(yàn)前反復(fù)倒置以混合試劑和樣品。

試劑準(zhǔn)備：

1）1X洗滌液的配制：用生物學(xué)或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖 液，我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中，沖洗掉所有晶體，旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存6個(gè) 月。總代理華南生物工程有限公司。使用前請(qǐng)檢查洗滌液是否被污染。

2）包被板的準(zhǔn)備：將實(shí)驗(yàn)所需數(shù)目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中，并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
操作步驟：

1）陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控都必須做雙份檢測(cè),DENRA和NCA都要檢測(cè)，未知血清樣品可做一份或雙份，DENRA和NCA都要檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)上的操作流程圖進(jìn)行操作。

2）將實(shí)驗(yàn)中使用的板條標(biāo)記好。

3）用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質(zhì)控品稀釋I00倍。用小聚丙烯試管進(jìn)行稀釋?zhuān)♂寱r(shí)至少需要4ul血清、陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。如：4ul血清加396ul稀釋液。

4）用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。注意，所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測(cè)。

5）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。

注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個(gè)孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發(fā)，任何多余的封板膠必需被剪掉。

6）37℃下孵育1小時(shí)。注意：不要將微孔板疊放，必須單獨(dú)地分層平輔。這對(duì)于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤(rùn)的物質(zhì)，如濕紙巾等。

7）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。

9）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。（同步驟5）

10） 37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）

11） 溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

12） 用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標(biāo)記的酶聯(lián)物。

13） 用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。（同步驟5）

14） 37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）

15） 溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

16） 用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。

17） 室溫下溫育（無(wú)需蓋板）5min。

18） 溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

19） 用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。

20） 室溫避光溫育10min。

21） 溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。

22） 溫育后，450nm處測(cè) OD值。

登革熱IgM ELISA實(shí)驗(yàn)操作流程圖：