心臟血管化類器官(cVOs)和肝臟血管化類器官(hVOs)的培養(yǎng)步驟,包括細胞準備、微圖案化、分化誘導、生長因子和小分子的添加以及后續(xù)的培養(yǎng)和分析。
第一,心臟血管化類器官(cVOs)培養(yǎng)步驟
1. 細胞準備
- 使用人類多能干細胞(hPSCs),包括人類胚胎干細胞(hESCs)和誘導多能干細胞(hiPSCs)。
- 維持hPSCs在Essential 8(E8)培養(yǎng)基中,每3-4天傳代一次。
2. 微圖案化
- 使用硅膠模具(stencil)在多孔板中創(chuàng)建2-6毫米直徑的圓形hPSC單層微圖案。
- 將模具放置在孔板中,用Matrigel(1:100稀釋)覆蓋模具,凝固后移除模具,留下微圖案化的hPSCs。
3. 分化誘導
- 第0天:添加4或5 μM CHIR(GSK3β抑制劑)和5 ng/ml FGF2。
- 第3天:添加5 μM IWR(Wnt信號通路抑制劑)。
- 第5天:開始添加血管誘導因子,包括50 ng/ml VEGF(血管內皮生長因子)。
- 第7天:繼續(xù)添加5 ng/ml FGF2、10 μM SB(TGF-β信號通路抑制劑)、50 ng/ml ANG2(血管生成素2)。
- 第9天:添加50 ng/ml ANG1(血管生成素1)。
- 第11天:繼續(xù)添加5 ng/ml FGF2、10 ng/ml PDGF-BB(血小板衍生生長因子)。
- 第13天:添加2 ng/ml TGF-β1(轉化生長因子β1)。
- 第15天:繼續(xù)添加5 ng/ml FGF2、10 ng/ml PDGF-BB、2 ng/ml TGF-β1。
4. 培養(yǎng)和分析
- 在分化過程中,使用時間序列成像技術(如Incucyte S3)監(jiān)測細胞的形態(tài)變化。
- 使用共聚焦顯微鏡進行高分辨率成像,以觀察細胞類型和血管結構。
- 通過單細胞轉錄組學(scRNA-seq)分析細胞類型和基因表達。
- 進行電生理學(如多電極陣列MEA和電極記錄)和鈣成像分析,以評估cVOs的功能特性。
第二, 肝臟血管化類器官(hVOs)培養(yǎng)步驟
1. 細胞準備:使用與cVOs相同的hPSCs。
2. 微圖案化:同樣使用硅膠模具在多孔板中創(chuàng)建2毫米直徑的圓形hPSC單層微圖案。
3. 分化誘導
- 第0天:添加100 ng/ml Activin-A、10 ng/ml BMP-4、3 μM CHIR、100 ng/ml FGF2和10 μM LY294002(PI3K-AKT抑制劑)。
- 第3天:添加50 ng/ml FGF-10。
- 第6天:添加10 ng/ml FGF10和10 ng/ml BMP-4。
- 第3天或第6天:開始添加血管誘導因子,包括50 ng/ml VEGF、5 ng/ml FGF2、10 μM SB、50 ng/ml ANG2、50 ng/ml ANG1。
- 第7天至第20天:繼續(xù)添加上述血管誘導因子,并根據需要調整生長因子和小分子的濃度。
4. 培養(yǎng)和分析
- 使用與cVOs相同的成像技術和分析方法來觀察hVOs的形態(tài)和功能。
- 通過免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡成像,確認肝臟細胞(HCs)、內皮細胞(ECs)和平滑肌細胞(SMCs)的存在和整合。
- 通過單細胞轉錄組學分析hVOs的細胞類型和基因表達。
通過這些詳細的步驟,研究人員成功地在體外模擬了人類心臟和肝臟的早期血管化過程,為研究心血管和肝臟疾病提供了新的模型和工具。
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