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什么是免疫組織組化？

免疫組織化學 (IHC) 是一種利用抗體結(jié)合組織切片中特定抗原并使用熒光基團或有色底物可視化的技術(shù)?？梢暬鞍椎奈恢糜兄谖覀兞私饧毎愋图捌湓诮M織中的功能?；话愕?IHC 染色通常需要樣品制備，抗原修復，封閉，靶標檢測和可視化。在此，我們總結(jié)了 IHC 的基本步驟和用于獲得發(fā)表級質(zhì)量圖像的工具。

本頁內(nèi)容：

· 五步獲取文獻級免疫組化（IHC）圖像

· 免疫組化（IHC）實驗建議和技巧

五步獲取文獻級免疫組化（IHC）圖像的實驗步驟

步驟1：制備樣本

組織樣品的制備方法決定了如何用抗體檢測抗原。這需要合適地保存樣本供短期或長期使用，切片，包括在組織染色過程之前將組織切片放置到載玻片上。冷凍或石蠟包埋是保存組織的兩種常用方法。每種方法都有優(yōu)點和缺點。

冷凍樣品制備

將標本浸入超冷液體 (如液氮或在干冰中浸沒) ，對組織樣品進行卡扣冷凍。冷凍組織適合在 -80° C 下短期儲存長達一年。冷凍組織切片由冷凍狀態(tài)生成。

組織冷凍具有一些優(yōu)勢，包括：

· 快速保存組織樣品

· 無需抗原暴露

· 是檢測翻譯后修飾 (如磷酸化) 的方法。

使用冷凍樣品的主要缺點是如果組織未迅速冷凍，可能形成冰晶對組織造成損傷。

石蠟包埋樣品制備

石蠟包埋組織，也稱為福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織，更有利于保持組織形態(tài)和長期儲存。該方法需要幾個步驟來清除樣本中的大部分水，然后用疏水物質(zhì)如石蠟滲透。步驟包括：

1. 組織被灌注或浸沒在甲醛溶液等固定劑中長達 24 小時

2. 逐步提高乙醇濃度進行脫水

3. 使用透明化試劑 (如二甲苯) 處理去除酒精

4. 將組織包埋于石蠟中；使用超薄切片機獲得 FFPE 組織切片

石蠟包埋的一個主要缺點是組織固定可能會掩蓋抗原決定簇，因此 FFPE 組織需要抗原修復來暴露抗原決定簇。另一個缺點是過度固定可能會導致高熒光背景，這可能會導致熒光染色出現(xiàn)問題。

樣品制備數(shù)據(jù)

圖 1.使用冷凍技術(shù)制備的免疫組織化學染色。對大鼠腦 (E13.5) 組織進行冷凍，切片并進行免疫組織化學染色，使用 Invitrogen SNAP25 多克隆抗體檢測 SNAP25 蛋白表達 (綠色)。還用抗 β 微管蛋白 3/ TUJ1 抗體 (紅色) 和 DAPI (藍色) 染色。

圖2.福爾馬林固定石蠟包埋組織的免疫組織化學染色。使用福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 技術(shù)制備人結(jié)腸癌組織切片。為了暴露靶蛋白，使用 10 mM 檸檬酸鈉 (pH 6.0) 緩沖液在 95°C 下進行熱誘導抗原決定簇修復 20 分鐘 抗原回收后，將組織置于室溫 3% Thermo Scientific Blocker BSA (10X) 的 PBS 中 封閉 30 分鐘，然后用 1 ： 100 稀釋的 Invitrogen Ezrin 單克隆抗體 (3C12) 進行 1 小時孵育。使用 Thermo Scientific Triton X-100 Surfact-Amps 去污劑溶液對組織進行充分洗滌 ，并使用 Thermo Scientific 過氧化物酶抑制劑 在室溫下淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性 30 分鐘。使用 Invitrogen 山羊抗小鼠 IgG (H+L) HRP二抗 在 1 ： 500 稀釋度下進行檢測，然后使用 Thermo Scientific 金屬增強型 DAB 底物試劑盒進行比色檢測。于40x的顯微鏡上成像。

步驟2：抗原修復

固定是保存組織形態(tài)的重要過程。但是，該過程可能導致蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而屏蔽抗原中的表位并限制抗原 - 抗體結(jié)合。抗原修復有助于通過破壞蛋白交聯(lián)來解屏蔽抗原決表位，并顯著提高抗體與目標蛋白的結(jié)合。

備注：冷凍切片或培養(yǎng)的細胞不需要抗原修復。所有抗體也不需要抗原修復。除非一抗來源明確表示需要，否則首先嘗試標記，無需抗原修復。

有兩種不同類型的抗原修復方法：熱誘導抗原修復 (HIER) 和蛋白酶誘導抗原修復 (PIER)。最佳的抗原修復方法取決于多種因素，包括組織類型，持續(xù)時間和固定方法以及一抗類型。為了獲得最佳結(jié)果，建議從熱誘導抗原修復 開始，這是一種更溫和的表位檢索方法，然后再嘗試蛋白酶誘導抗原修復。

熱誘導抗原修復 (HIER)

對于HIER ，方法是用回收緩沖液處理組織，同時在微波爐，雙鍋爐或壓力鍋中加熱。最常見的 HIER 緩沖液包括檸檬酸鈉 (pH 6.0) ， EDTA (pH 8.0) 和 Tris-EDTA (pH 9.0)。HIER 可能需要優(yōu)化條件，取決于所用緩沖液的時間，溫度和 pH 值，而不同的抗原和樣品可能因樣品和抗體而不同。

蛋白酶誘導的抗原決定簇修復 (PIER)

對于PIER，通過使用蛋白酶 K ，胃蛋白酶和胰蛋白酶等可以破壞交聯(lián)鍵而恢復抗原表位。使用PIER時要小心，因為過度的酶處理可能會損壞組織和改變組織形態(tài)。PIER可能也需要經(jīng)過優(yōu)化，取決于時間，溫度，酶類型和濃度。

抗原修復應用數(shù)據(jù)

圖3.使用熱誘導抗原修復進行的免疫組織化學染色。對脫蠟的人結(jié)腸癌組織的癌癥活檢進行 IHC。為了暴露靶蛋白，用 10 mM 檸檬酸鈉 (pH 6.0) 緩沖液溶液微波加熱 8 至 15 分鐘。按照這一步驟，在室溫下將組織封閉 3% BSA-PBS 30 分鐘。然后，使用 Invitrogen 肌動蛋白單克隆抗體 (mAbGEa) 或不使用一抗 (陰性對照) 在 4°C 孵育過夜，進行 1 ： 1000 稀釋的組織孵育。用 Poly 80 (PBST) 磷酸鹽緩沖鹽水廣泛洗滌組織，用過氧化物酶抑制劑淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。使用生物素偶聯(lián)的二抗和鏈霉親和素 -HRP 進行檢測，然后使用 DAB 進行比色檢測。組織用蘇木精復染并用蘇木精準備安裝。

圖4.使用酶抗原修復進行免疫組織化學染色。用人胎盤堿性磷酸酶 (hPLAP) 表達載體和石蠟包埋切片轉(zhuǎn)導的小鼠肺的免疫組織化學分析已經(jīng)過蛋白酶處理 12 分鐘。然后用 1 ： 100 稀釋的 Invitrogen 胎盤堿性磷酸酶多克隆抗體對各切片進行染色，然后用堿性磷酸酶結(jié)合二抗和比色底物 (紅色) 進行檢測。組織用蘇木精染色(藍色)。數(shù)據(jù)由創(chuàng)新者計劃提供。

步驟3：封閉

蛋白封閉是一種使用基于蛋白的組分與能夠結(jié)合抗體的技術(shù)。為了幫助介導這種情況，必須使用蛋白封閉試劑與其他非特異性蛋白結(jié)合。通過將組織樣品與可應對每個背景來源的特異性封閉試劑孵育，可極大程度地減少背景染色并減少假陽性信號。內(nèi)源性酶封閉，自發(fā)熒光和非特異性一抗和二抗結(jié)合是組織中背景信號的主要來源。

備注：對于細胞內(nèi)靶標染色，需要使用封閉試劑處理前透化組織切片。

內(nèi)源性酶封閉

內(nèi)源性酶封閉類型包括：

· 生物素封閉—如果您首先進行鏈霉素親和素 - 生物素擴增，則需要封閉樣品中的內(nèi)源性生物素。生物素主要存在于細胞線粒體中。

· 過氧化物酶封閉 - 對于 HRP 偶聯(lián)物檢測，如酪胺信號放大，則必須首先用 H2O2 封閉步驟將內(nèi)源性過氧化物酶滅活。

· 磷酸酶封閉—如果對堿性磷酸酶偶聯(lián)物 (如 BCIP/NBT) 進行檢測，內(nèi)源性磷酸酶必須首先被滅活。

自發(fā)熒光

自發(fā)熒光是由內(nèi)源性蛋白或化學處理引起的天然熒光背景。自發(fā)熒光通常是廣譜的，能夠降低信噪比，從而降低靈敏度。使用化學處理或擴增技術(shù)降低背景。

非特異性結(jié)合

可使用蛋白封閉試劑介導非特異性抗體結(jié)合。這些試劑結(jié)合到原本會吸引抗體的結(jié)構(gòu)上。并非所有蛋白封閉劑都同樣適用于所有靶標，需要依據(jù)具體情況選擇合適的。

封閉實驗應用數(shù)據(jù)

圖 5.使用封閉技術(shù)進行免疫組織化學染色的比色示例。使用福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 技術(shù)制備分化的人結(jié)腸腺癌組織切片。為了暴露靶蛋白，在 95°C 下使用 10 mM 檸檬酸鈉緩沖液 (pH 6.0) 進行熱誘導抗原決定簇修復 20 分鐘 抗原修復后， 在室溫下用 3% Thermo Scientific Blocker BSA (10X) 的 PBS 封閉 30 分鐘，然后用 1 ： 100 稀釋的 Invitrogen HSP90 多克隆抗體進行孵育 1 小時 (右圖)。陰性對照：染色過程中不加一抗 (左圖)。用Thermo Scientific Triton X-100 surface - amps洗滌劑溶液對組織進行充分洗滌，并用Thermo Scientific peroxidase Suppressor在室溫下滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性30分鐘。使用 Invitrogen 山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗 HRP 在 1 ： 250 稀釋的稀釋度下進行檢測，然后使用 Thermo Scientific 金屬增強型 DAB 底物試劑盒進行比色檢測。組織用蘇木精復染。圖像在40倍(x1.6 Optovar)的顯微鏡上拍攝。

圖 6.使用封閉技術(shù)進行免疫組織化學染色的熒光示例。使用福爾馬林固定石蠟包埋的人卵巢癌組織切片對 ACTA2 進行 IHC 分析。為了暴露靶蛋白，使用 eBioscience IHC 抗原修復溶液 - 在 110°C 的脫蠟室中稀釋至 1X 溶液的水中稀釋至 1X 溶液進行熱誘導的抗原修復 15 分鐘?？乖迯秃螅瑢⑶衅谑覝叵掠?1X PBS 中的 2% 正常山羊血清封閉 45 分鐘，然后 在 4°C 孵育過夜時，在 0.1% 正常山羊血清中以 1 ： 100 稀釋度用 eBioscience α 平滑肌肌動蛋白單克隆抗體 (1A4) 進行檢測，孵育過夜。使用 Invitrogen 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高交叉吸附的二抗 Alexa Fluor Plus 488 ，在室溫下于 0.1% 正常山羊血清中以 1 ： 2,000 稀釋 45 分鐘進行檢測。使用Invitrogen ReadyProbes 組織自發(fā)熒光 淬滅試劑盒用于淬滅組織中的自發(fā)熒光。細胞核用 Invitrogen DAPI 染色 ，并使用 Invitrogen ProLong Glass 抗淬滅封片劑封片切片。圖像是在 Invitrogen EVOS M7000 成像系統(tǒng) (貨號AMF7000) 20x采集。

步驟4：檢測

通過直接或間接染色方法使用熒光或發(fā)色偶聯(lián)抗體檢測靶標。

熒光染料 ，如 Alexa Fluor 或 Alexa Fluor Plus 偶聯(lián)物是免疫熒光染料之一。酪胺信號放大可用于增強低豐度和難以檢測的靶標并提高靈敏度熒光檢測。

辣根過氧化物 酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 是化學發(fā)光常用的酶偶聯(lián)物。

備注：化學或熒光復染可用于補充抗體染色，檢查離散的細胞。

間接染色

對于組織間接染色，可使用未偶聯(lián)的一抗與熒光或酶偶聯(lián)的二抗組合。

備注：為確保成功染色，請務(wù)必選擇經(jīng)過驗證的一抗用于 IHC 應用。

圖7.直接和間接檢測策略的比較示意圖。

間接染色方案：

· IHC 冷凍組織 - 間接方法 (使用純化抗體)

· IHC 冷凍組織 - 間接方法 (使用生物素化抗體)

· IHC FFPE 組織胰蛋白酶酶切—間接方法

· IHC FFPE 組織低 pH 值抗原修復—間接方法

· IHC FFPE 組織高 pH 值抗原修復—間接方法

直接檢測

組織直接染色不需要使用二抗。使用偶聯(lián)一抗直接染色。

備注：為確保成功染色，請務(wù)必選擇經(jīng)過驗證的一抗用于 IHC 應用。

直接染色方案：

· IHC 冷凍組織—直接方法

· IHC FFPE 組織胰蛋白酶酶切—直接方法

· IHC FFPE 組織低 pH 值抗原修復—直接方法

· IHC FFPE 組織高 pH 值抗原修復—直接方法

檢測應用數(shù)據(jù)

圖8.人 iPSC 誘導的前腦類器官中 β -3 微管蛋白 (綠色) 和 PAX6 (洋紅色) 的免疫組織化學分析。在第 40 天，人體 iPSC 誘導的類器官在室溫下用 4% 甲醛固定 1 小時，并在 4°C 下在 30% 蔗糖溶液中培養(yǎng)過夜。然后將類器官包埋在OCT包埋劑中，在以5µm處冷凍切片，用0.2% Triton X-100洗滌劑滲透20分鐘，用10%驢血清在PBS中封閉30分鐘。將類器官切片與 Invitrogen 抗 β -3 微管蛋白小鼠單克隆抗體 (克隆號 2G10) 1 ： 500 稀釋 和 Invitrogen 抗 PAX6 兔多克隆抗體在 4°C 下過夜， 然后用 1 ： 1 ， 000 稀釋的 Invitrogen Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG ReadyProbes 二抗 (綠色) 和 Invitrogen Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 二抗 (洋紅色) 以及 DAPI (藍色) 在室溫下封閉溶液中染色 1 小時圖像在顯微鏡上20x采集。Scale bar: 50 µm.經(jīng)美國喬治亞州亞特蘭大市埃默里大學醫(yī)學院助理教授溫哲星同意轉(zhuǎn)載。

圖9.骨骼肌組織靶標的比色檢測。對使用福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 技術(shù)制備的人骨骼肌組織進行免疫組織化學分析。為了暴露靶蛋白，于0 mM 檸檬酸鈉緩沖液 (pH 值 6.0) 進行 10 分鐘抗原熱誘導修復?？乖迯秃?，將組織用 3% BSA-PBS 封閉 30 分鐘，然后使用 (右圖) 或不使用 (左圖) Invitrogen Musk 多克隆抗體 (兔， 稀釋： 1 ： 20 過夜，°置于加濕腔室內(nèi)。用Thermo Scientific Triton X-100 Surfact-Amps洗滌劑充分清洗組織，用Thermo Scientific peroxidase Suppressor淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下30分鐘。使用 Invitrogen 山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗 HRP 進行檢測 ，然后使用 Thermo Scientific 金屬增強型 DAB 底物試劑盒進行比色檢測。組織用蘇木精反染。

福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 扁桃體組織的免疫組織化學分析。使用SuperBoost (A) EverRed & (B) EverBlue染色或(C) DAB染色分析人扁桃體組織FFPE切片。為了暴露靶蛋白，使用 10 mM 檸檬酸鈉 (pH 6.0) 進行熱誘導抗原修復 (HIER) ，然后在壓力鍋中加熱 20 分鐘。HIER 后，將組織在室溫下 3% H2O2 孵育 10 分鐘，用封閉試劑封閉，然后在 4°C 下用 Invitrogen Ki-67 單克隆抗體 (貨號號 MA5-14520) ，以 PBS/3% (w/v) BSA 中按 1 ： 20 稀釋。樣本廣泛溶于含 0.05% (v/v) 吐溫 -20 (PBST) 的 PBS 緩沖液中洗滌。使用 SuperBoost (A) EverRed 山羊抗兔 IgG (貨號 A) 進行檢測號 E40967) ， (B) EverBlue 山羊抗兔 IgG (貨號號 E40968) ，或 (C) DAB ，使用 SuperBoost 山羊抗兔 Poly HRP IgG (貨號號 B40962)。封片前用乙醇和二甲苯脫水。使用EVOS M7000成像系統(tǒng)(貨號 AMF7000) ， 4 x物鏡采集。

步驟5：成像

最后一步進行成像。染色組織玻片通常通過光學或熒光顯微鏡觀察，并使用寬場或共聚焦成像模態(tài)。多種高內(nèi)涵系統(tǒng)可實現(xiàn)自動采集和分析，使用低放大倍數(shù)識別組織切片。然后，可使用較高放大倍數(shù)重新掃描區(qū)域。

封片劑

在拍攝圖像之前， 請務(wù)必選擇合適的封片劑以保持良好的樣品狀態(tài)并避免可能發(fā)生的任何光漂白問題。以下是運行 IHC 時可能出現(xiàn)的幾種情況：

· 如果使用熒光染料，請務(wù)必使用抗淬滅的封片劑，減緩染料的光漂白。

· 如果需要立即對樣品進行成像，則最好使用非固化封片劑。

· 如果要長期保存切片，應選擇固化封片劑。固化膠能固化成堅硬的凝膠，適合長期儲存。

成像采集的應用數(shù)據(jù)

圖10.免疫組化染色樣品的熒光成像分析。依據(jù)標準 IHC 方案，大鼠十二指腸冷凍切片經(jīng)抗組蛋白 H3 一抗染色后，使用 Invitrogen 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高交叉吸附的二抗 Alexa Fluor Plus 488 (綠色)檢測 。然后用 Invitrogen CellMask 深紅色肌動蛋白示蹤染色劑 (洋紅色) 和 Hoechst 34580 ( 藍色) 染色 1 小時然后用 Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant 安裝組織切片。AI潤色 72/5000 使用Invitrogen EVOS M7000成像系統(tǒng)拍攝圖像。

圖11.CellInsight CX7 HCA 平臺采集和分析數(shù)據(jù)。對頸部彌漫性大B細胞淋巴瘤的組織微陣列進行了蘇木精染色細胞核、伊紅染色細胞質(zhì)和人抗ki -67染色，后續(xù)使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應。(A) 使用藍光，綠色光和紅色光源以及 40 倍物鏡和平鋪板來分別采集染色組織微陣列芯樣品。(B) 圖像采用顏色編碼，以表示使用彩色相機采集的典型圖像。(C) 對圖像進行單獨分析：檢測，分析并與陣列中的其他組對比檢測結(jié)果 (藍色輪廓) 和 Ki-67 染色 (紅色點)。

獲取高質(zhì)量免疫組化（IHC）圖像的五個實驗步驟和建議

1. 免疫組化（IHC）樣品制備

組織樣品的制備方法決定了如何用抗體檢測抗原。選擇滿足預期實驗結(jié)果需要的組織類型相兼容的固定方法是很重要的。如果您需要好的抗原修復結(jié)果并且不必保持細胞形態(tài)，則使用冰凍組織或丙酮固定。當需要保持細胞形態(tài)時，福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE)組織樣品是一個好的選擇。

對于細胞固定，可選擇：Image-iT固定/通透化處理試劑盒

2. 免疫組化（IHC）抗原修復

抗原修復是免疫組化（IHC）在進行抗體標記前的必要步驟，因為組織的固定過程通常會引起蛋白交聯(lián)。這在使用福爾馬林固定時因其化學屬性而經(jīng)常發(fā)生，但可以通過加熱的方法、簡易緩沖液處理或蛋白酶消化而輕松實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。處理的方式可根據(jù)抗體檢測所需的表位構(gòu)型而進行選擇。該步驟可使得抗原表位被重新暴露以便于抗體的結(jié)合。

熱修復，可選用如下緩沖液：

eBioscience IHC抗原修復溶液 - 高pH(10X)
eBioscience IHC抗原修復溶液 - 低pH(10X)

3. 免疫組化（IHC）背景封閉

組織中內(nèi)源性酶和抗體的封閉對于背景染色的最小化以及降低假陽性染色十分重要。這通常是通過用可封閉一抗或二抗也可能結(jié)合的非特異性位點的特定緩沖液對樣品進行孵育而實現(xiàn)的。

封閉非特異性染色，可選用：

eBioscience IHC /ICC封閉液 - 低蛋白
eBioscience IHC /ICC封閉液 - 高蛋白
親和素/生物素封閉試劑盒
CAS-封閉組化試劑
Blocker FL熒光封閉液

4. 免疫組化（IHC）檢測目標

在選擇一抗時，確保其已通過驗證可用于免疫組化（IHC）應用。Invitrogen抗體產(chǎn)品含有約60,000種經(jīng)免疫組化（IHC）優(yōu)化和測試的高質(zhì)量抗體。一抗有非偶聯(lián)的（用于間接法）以及偶聯(lián)的形式用于直接檢測或多重檢測的方法。二抗也有一系列的偶聯(lián)形式用于基于比色/發(fā)光或染色的免疫組化（IHC）。

每一種抗體都提供即用型的形式：

· 用于免疫組化（IHC）的Invitrogen抗體已有超過21,000次引用

· 具有穩(wěn)定性能的免疫組化（IHC）實驗驗證過的抗體

· 在石蠟及冰凍切片中的功能性驗證

· 一抗和二抗產(chǎn)品是對其他賽默飛產(chǎn)品在免疫組化（IHC）工作流程（完整工作流程，用于免疫組化的每一步）中的完善補充

· 免疫組化（IHC）抗體來源、儀器、試劑以及技術(shù)信息

· 升級后的網(wǎng)站可實現(xiàn)輕松搜索和訂購

· Alexa Fluor及Alexa Fluor Plus偶合物為基于熒光的免疫組化（IHC）提供了眾多選擇

除了抗原檢測外，免疫組化（IHC）制備的組織切片也可用于細胞過程的分析。Click系列試劑，可通過結(jié)合EdU標記并通過傳統(tǒng)的比色法染色，實現(xiàn)對于固定組織中細胞增殖的直接檢測。此外，Click系列試劑與TUNEL標記的結(jié)合可用于發(fā)生在凋亡過程中片段化DNA的比色法檢測。

增殖或凋亡的建議比色法檢測，可選用：

Click-iT EdU比色法IHC檢測試劑盒
Click-iT TUNEL比色法IHC檢測試劑盒

5. 免疫組化（IHC）觀察樣本

Thermo Fisher Scientific可提供幾款最為先進的顯微鏡，用于通過比色或熒光標記抗體組織染色的免疫組化（IHC）圖像獲取。

EVOS系列智能細胞成像分析系統(tǒng)：

· 用于簡易觀察發(fā)光染色：

o EVOS XLCore

o EVOS FLoid

· 用于簡易觀察熒光染色：

o EVOS M5000

· 用于簡易觀察和分析發(fā)光染色和熒光染色：

o EVOS M7000

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