可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）試劑盒說明書

分光光度法

可溶性淀粉合成酶試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游離態(tài)存在于質(zhì)體基質(zhì)中，催化淀粉鏈延長(zhǎng)，主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。

測(cè)定原理：

SSS 催化ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP，在反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原為NADPH，NADPH 生成量與前一步反應(yīng)中 ADP 生成量呈正比，340nm 下測(cè)定NADPH 增加量即可計(jì)算SSS 活性。

組成：

BM6005-25T/24S 試劑二臨用前加入 7ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-25T/24S 試劑三臨用前加入 4ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-25T/24S 試劑四臨用前加入 9ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-25T/24S 試劑五臨用前加入 0.5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-25T/24S 試劑六臨用前加入 0.5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-50T/48S 試劑二臨用前加入 14ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-50T/48S 試劑三臨用前加入 8ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-50T/48S 試劑四臨用前加入 17ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-50T/48S 試劑五臨用前加入 1ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BM6005-50T/48S 試劑六臨用前加入 1ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液制備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 4℃離心 10min，取上清液（如果一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

SSS 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，7.8×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.15 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量。

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