實(shí)驗(yàn)方法原理    首先建立家兔椎間盤細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，組給予純氧，另外3組給予不同濃度的臭氧：30 μg/ml，60 μg/ml和80 μg/ml，然后于15 min及30 min后，采用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞排斥試驗(yàn)計(jì)算椎間盤細(xì)胞的活細(xì)胞率。
實(shí)驗(yàn)材料    
家兔

試劑、試劑盒    
培養(yǎng)液DMEMHanks’緩沖液胎牛血清胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白鹽青霉素鏈霉素

儀器、耗材    
培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶燒瓶試管眼科剪、眼科鑷CO2 培養(yǎng)箱pH 計(jì)恒溫水浴

實(shí)驗(yàn)步驟    
一、實(shí)驗(yàn)步驟

1.  組織塊貼塊法

（1）取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無菌狀態(tài)下獲取家兔椎間盤組織。置于準(zhǔn)備好的DMEM 培養(yǎng)基(含雙抗)。迅速帶回到無菌超凈臺(tái)上。

（2）剪切：在超凈臺(tái)上，進(jìn)一步將周圍組織分離，用Hanks’液沖洗數(shù)遍，直到?jīng)_洗液透明為止。眼 科剪刀將組織修剪為1~2 cm3 大小的小組織塊，Hanks’沖洗干凈。加入少量含血清的培養(yǎng)液。(組織塊不宜過小，否則不容易爬出足夠數(shù)量的細(xì)胞)。

（3）接種：用吸管吸取小組織塊入培養(yǎng)瓶底部，擺放均勻，一個(gè)25 cm2 的培養(yǎng)瓶可放置10-15 個(gè)小組織塊，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入少量培養(yǎng)液。4~6 小時(shí)后，待組織塊充分貼壁后，再翻轉(zhuǎn)回來(動(dòng)作一定要輕巧， 以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底)。

（4）于5% CO2 孵箱中培養(yǎng)，每隔 3 天換液。待細(xì)胞 95%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶。

2.  酶消化法

（1）前面步驟同組織塊貼塊法 1、2。

（2）組織塊再進(jìn)一步剪切，此時(shí)培養(yǎng)液中不加血清。

（3）完畢后，加入消化液，移入到10  ml 離心管，培養(yǎng)箱內(nèi)消化。

（4）每隔20 分鐘，用吸管吹打一次，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體，在相差倒置顯微鏡下觀察。

（5）0.4%臺(tái)盼蘭染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目。

（6）接種密度在105 數(shù)量級(jí)。置于5%CO2 孵箱中培養(yǎng)，每隔 3 天換液。

（7）待細(xì)胞 95%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶。

二、結(jié)果

IVD 細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，描述：單層細(xì)胞形狀不規(guī)則，可呈三角形、多角形，梭形及不規(guī)則形。不同于成纖維細(xì)胞。如下圖：

圖1：組織塊貼塊法
 

圖2：傳代細(xì)胞形態(tài)
 

收起 
注意事項(xiàng)    
 椎間盤位于相鄰兩個(gè)椎體之間，取材過程較為繁瑣， 要求動(dòng)作迅速，爭取在家兔死后半小時(shí)內(nèi)完成，否則，該組織對(duì)缺氧耐受性差導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。