實(shí)驗(yàn)方法原理    
 
本實(shí)驗(yàn)用Dynabeads protein A 進(jìn)行免疫復(fù)合物的純化。Dynabeads A 蛋白 （Dynabeads Protein A） 在免疫沉淀中有以下作用：

（1）將方案時(shí)間減少到 30 分鐘。

（2）顯著降低非特異性結(jié)合造成的背景

（3）保持蛋白質(zhì)復(fù)合物的完整。對(duì)珍貴的蛋白質(zhì)沒有物理壓力。

實(shí)驗(yàn)材料    腫瘤細(xì)胞
試劑、試劑盒    PBS生理鹽水裂解液蛋白酶抑制劑
儀器、耗材    培養(yǎng)瓶細(xì)胞刮棒離心管低溫離心機(jī)-80℃冰箱探針型超聲波恒溫水浴鍋
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、 裂解細(xì)胞

1.  方向刮取細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，離心取沉淀，-80℃ 保存。（收集細(xì)胞要迅速，低溫下進(jìn)行，以減弱蛋白酶的作用）

2.  裂解細(xì)胞。采用RIPA 裂解體系，使用前40℃ 預(yù)冷，按107 個(gè)細(xì)胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混勻，加入適量的蛋白酶抑制劑
（如cocktail）， 冰上放置3~5 分鐘。

3.  超聲處理裂解液。使用探針型超聲進(jìn)行多次適當(dāng)頻率的短促?zèng)_擊，10~20秒/次，重復(fù)3 次，中間間隔10~20 秒，冰浴下進(jìn)行。

4.  15 000 rpm，40℃離心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的預(yù)處理。
 
二、裂解物的預(yù)處理

使用正常人的血清對(duì)裂解物進(jìn)行預(yù)處理。

1.  按1 ml 裂解物加2 ul 對(duì)照血清的比例加入正常人血清。

2.  室溫孵育2~3 小時(shí)，緩慢搖動(dòng)。

三、免疫復(fù)合物的純化

1.  用Dynabeads protein A 進(jìn)行免疫復(fù)合物的純化。
 
2.  將Dynabeads protein A 振蕩混勻，吸取100 ul 磁珠于EP 管中，置于磁鐵架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。
 
3.  加500 ul 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，輕柔搓動(dòng)管子約2~3 min，將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。
 
4.  重復(fù)2 步驟兩次。
 
5.  清洗完磁珠后，加500 ul 預(yù)處理后的裂解物，反復(fù)搖動(dòng)管子，室溫下反應(yīng)10~20 min。
 
6.  將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。
 
7.  用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。
 
8.  洗脫抗原-抗體復(fù)合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 ul于Ep 管中，輕柔搓動(dòng)管子約2~3 min，將P管置于磁鐵架上，吸取上清于一EP管。
 
9.  重復(fù)步驟7，將上清收集于同一個(gè)EP管洗脫樣品總體積為60 ul，作對(duì)照用。
 
10.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后備用。
 
11.  在步驟5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 ul 血清），緩慢搖動(dòng)，室溫孵育2~3 h。
 
12.  將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。
 
13.  重復(fù)步驟6~8。共收集到兩份樣品，對(duì)照與病人的純化免疫復(fù)合物各60 ul。
 
14.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱儲(chǔ)液100 ul，40℃ 保存。
 
15.  在樣品中加入2xSDS 上樣緩沖液并用1 M NaOH 調(diào)節(jié)pH 至使溴酚藍(lán)呈藍(lán)色。
 
四、結(jié)果分析

1.  1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的樣品可直接進(jìn)行一維凝膠電泳，或者對(duì)磁珠上的蛋白A 或蛋白G 進(jìn)行耦聯(lián)劑修飾，洗脫后的樣品可進(jìn)行Western Blot。

2.  RIPA裂解液：
150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脫氧膽酸鈉； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。
收起 
注意事項(xiàng)    
為了避免抗體的共洗脫，在繼續(xù)進(jìn)行免疫沉淀之前，應(yīng)該將抗體交聯(lián)到免疫磁珠,建議使用交聯(lián)劑。
其他    
Dynabeads protein A 捕獲的 Ig 量取決于起始樣品中 Ig 的濃度。 100 µl Dynabeads A 蛋白可從含有 20- 200 µg IgG ⁄ml 的樣品中分離約 25- 30 µg 人 IgG。 絕大部分位點(diǎn)與 Fc 結(jié)合，實(shí)現(xiàn)的 Ig 取向。