產(chǎn)品及特點 | 牛細(xì)小病毒(Bovine Parvovirus,BPV) 會引發(fā)牛細(xì)小病毒感染，是一種接觸性傳染病,以下痢為主要癥狀,其特征是母牛生殖機(jī)能障礙，導(dǎo)致妊娠母牛感染導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，犢牛感染則表現(xiàn)腸炎、腹瀉。牛細(xì)小病毒感染在牛群中發(fā)生比較廣泛，目前國內(nèi)外對其研究的較少,發(fā)生此病的國家也不多，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測牛細(xì)小病毒的試劑盒，它具有下列特點： - 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
- 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
- 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
- 特異性高，引物是根據(jù)牛細(xì)小病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
- 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
- 本產(chǎn)品只能用于科研。
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規(guī)格及成分 | 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 | 2×Probe qPCR MagicMix | 190303 | 0.5 mL（本色蓋） | 熒光PCR模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） | 牛細(xì)小病毒 PCR引物 | 15-44000yw | 100 μL（白蓋） | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 15-44000pro | 100 μL（棕色管） | 牛細(xì)小病毒陽性對照2.0 (1×10E8拷貝/μL) | 15-44000pc | 50 μL（紅蓋） | 天凈沙核酸釋釋劑試用裝 | 61202 | 50次（2.5mL） | 使用手冊 | 15-44000sc | 1份 |
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運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個月。 | |
自備試劑 | 樣品DNA。 | |
使用方法 | 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。 - 標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備 - 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
- 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 牛細(xì)小病毒 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
- 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
過程 | 溫度 | 時間 | 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min | PCR反應(yīng) （40個循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min | 55℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號） | 72℃ | 0.5 min | 后延伸 | 72℃ | |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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成分 | 編號 | 十孔盒包裝 | 2×Probe qPCR MagicMix | 190303 | 0.5 mL（本色蓋） | 熒光PCR模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） | 牛細(xì)小病毒 PCR引物 | 15-44000yw | 100 μL（白蓋） | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 15-44000pro | 100 μL（棕色管） | 牛細(xì)小病毒陽性對照2.0 (1×10E8拷貝/μL) | 15-44000pc | 50 μL（紅蓋） | 天凈沙核酸釋釋劑試用裝 | 61202 | 50次（2.5mL） | 使用手冊 | 15-44000sc | 1份 |
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低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個月。 | |
樣品DNA。 | |
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。 - 標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備 - 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
- 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 牛細(xì)小病毒 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
- 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
過程 | 溫度 | 時間 | 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min | PCR反應(yīng) （40個循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min | 55℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號） | 72℃ | 0.5 min | 后延伸 | 72℃ | |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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