產(chǎn)品名稱：HCT8/DDP人結腸癌順鉑耐藥株細胞 處理方法 含STR鑒定

細胞污染： HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

細胞傳代步驟： 如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細胞復蘇步驟： 將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

細胞凍存步驟： 待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；1．細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml*培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

HCT8/DDP人結腸癌順鉑耐藥株細胞 的特點主要可以概括成三點：

① 持久性:細胞分化貫穿于生物體整個生命進程中,在胚胎期達到*程度

② 穩(wěn)定性和不可逆性:一般來說,分化了的細胞將一直保持分化后的狀態(tài),直到死亡

③ 普遍性:生物界普遍存在,是生物個體發(fā)育的基礎

HCT8/DDP人結腸癌順鉑耐藥株細胞 處理方法 含STR鑒定培養(yǎng)條件

RPMI164010%FBS

細胞生長：貼壁生長

細胞形態(tài)：上皮樣

細胞數(shù)量：1×106個細胞數(shù)

細胞傳代：1：3傳代3~4天1次

剛收到細胞時，胎牛血清可以用15%培養(yǎng)兩三天，利于細胞盡快恢復狀態(tài)，細胞穩(wěn)定后

再調回10%即可

   收到細胞后如細胞狀態(tài)不佳，或培養(yǎng)中遇到問題，煩請當天盡快聯(lián)系，以便處理。當天及時反饋細胞情況和細胞照片是售后跟蹤處理重要參考依據(jù)，請您務必重視。

1. 為什么培養(yǎng)的細胞要及時傳代？

    答：體外培養(yǎng)的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細胞的生長得以繼續(xù)。

2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？

    答：通常細胞生長得非常快時，pH值通常下降得很快。此時可以及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細菌、酵母或真菌污染等也能導致pH值通常下降得很快。

       (1)按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。

       (2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。

       (3)松開瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。

       (4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

       (5)如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。

3.培養(yǎng)液pH對細胞生長的影響？

    答：由于大多數(shù)細胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細胞生長將產(chǎn)生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些。在配制培養(yǎng)用液時，需要注意一點：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。

4.購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？

    答：研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對于DMSO敏感的細胞，還是復蘇細胞時，用離心去除DMSO比較好。

5.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

    答：研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細胞置于–80 ℃太久等。建議嚴格參照ATCC或ECACC的標準操作規(guī)程進行細胞復蘇、凍存等工作。

6.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

    答：支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。

7.冷凍保存細胞之方法？

    答：冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃(30－60 分鐘)→-20℃( 30 分鐘) → -80℃(16－18 小時或隔夜)→ 液氮罐長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下， 再放入液氮中長期儲存。注意：-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

8.懸浮細胞應如何繼代處理？

    答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時可分瓶取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

9.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

    答：欲回收動物細胞，其離心速率一般為300×g (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉速過長時間都將造成細胞死亡。合適的離心轉速是根據(jù)相對離心決定。 RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中 r為離心機轉軸中心與離心套管底部內(nèi)壁的距離；rpm為離心機每分鐘的轉數(shù)；RCF(relative eentrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示表示單位。

10.培養(yǎng)細胞時應使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？

    答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應使用10% CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養(yǎng)細胞。

11.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除DMSO？

    答：除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)，在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12.冷凍管應如何解凍？

    答：取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細胞，用75％消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細胞轉移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂

13.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？

    答：將樣品適當稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4％的臺盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點樣到血球計數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)，其中藍色細胞是死細胞，因活細胞排斥臺盼蘭，不被染色。

14.細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？

    答：冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial。

15.細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

    答：動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

16.如何消除組織培養(yǎng)的污染？

    答：當重要的培養(yǎng)細胞污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。