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材料與儀器：
抗體
PBS 伊文氏蘭
顯微鏡
實驗步驟：
1. 標本固定后，PBS洗滌3x3 分鐘；
2. 滴加一抗，37 ℃40 分鐘或4 ℃過夜；
3. PBS洗3x3 分鐘；
4. 滴加熒光標記二抗37 ℃，40 分鐘；
5. PBS洗3x3 分鐘；
6. 0.1 %伊文氏蘭復染；
7. PBS洗3x3 分鐘；
8. 緩沖甘油封片，鏡檢。
要點：
1.種屬在進行雙重免疫標記時，要選擇來源于兩種不同種屬動物的一抗，如選擇來源于rabbit和mouse的抗體，二抗則用帶有不同熒光素標記的，如抗rabbit或抗mouse二抗， FITC和Tex-Red;
2.孵育時間和溫度相同的兩種一抗可以同時孵育，然后加入相對應的一抗的二抗進行孵育，一抗孵育時間室溫至少需要16h,二抗孵育室溫不宜超過4h,選擇4℃孵育比較好，背景比較清晰，另外孵育時夏天特別注意室溫溫度；
3.抗體稀釋液通常第一抗體選擇1%牛血清白蛋白進行稀釋，第二抗體選擇用0.01mol/L的PBS稀釋。
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