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原理
用機(jī)械法從細(xì)胞單層分離細(xì)胞，在 27°C 條件下和懸浮狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
材料與儀器
Sf9細(xì)胞 二甲基亞砜 Pluronic F68
生長培養(yǎng)液
培養(yǎng)瓶 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶和磁力攪拌器 27°C培養(yǎng)箱
步驟
常規(guī)維持培養(yǎng)
1. 通過刮取法或用培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或從甘藍(lán)環(huán) Trichoplusia ni 獲得的細(xì)胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也稱 “High Five ”，可從 Invitrogen 購買））法使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中脫落，或者利用在旋轉(zhuǎn)瓶中懸浮生長的細(xì)胞。
2. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，通過用臺(tái)盼藍(lán)或萘黑染色檢査細(xì)胞的活力。
3. 以 0.5~1×106 個(gè)/ml 活細(xì)胞密度將細(xì)胞種植于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶內(nèi)，每 500 ml 旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)注入 20~100 ml 細(xì)胞懸液。
4. 在 20~28°C 條件下培養(yǎng)細(xì)胞，以 37°C 為佳。
5. 每 48~72 h 或當(dāng)細(xì)胞密度為 4~5×106 個(gè)/ml 時(shí)，將細(xì)胞稀釋至 0.5~1×106 個(gè)/ml。
6. 每 3~4 周將細(xì)胞移入潔凈的培養(yǎng)瓶。
7. 如果細(xì)胞群聚集，稍微加快攪拌速度，并加入表面活性劑 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。
凍存細(xì)胞
1. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，離心（1000 rpm ，約 200 g，5 min )。
2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混懸細(xì)胞，密度為 1×107 個(gè)/ml。
3. 將細(xì)胞分裝入凍存管，然后將凍存管放在冰上 1 h。
4. 將凍存管裝入苯乙烯泡沫容器。
5. 在 -70°C 條件下將凍存管緩慢冷凍過夜（約 1°C /min )。
6. 將凍存管移入液氮凍存器中。
7. 使凍存的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將凍存管在 37°C 迅速融化。如果細(xì)胞以液相儲(chǔ)存，在融化加蓋容器中的細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意避免因凍存管破裂而導(dǎo)致受傷的危險(xiǎn)。
8. 將細(xì)胞移入含 5 ml 培養(yǎng)液的 25 cm2 培養(yǎng)瓶。輕拍培養(yǎng)瓶，以便均勻地分散細(xì)胞。
9. 2~3 h 后吸去培養(yǎng)液。當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞貼壁時(shí)，加入 5 ml 新鮮培養(yǎng)液。
10. 在分離前將細(xì)胞培養(yǎng) 2~3 天，使細(xì)胞恢復(fù)。然后按前述方法，將細(xì)胞移入攪拌培養(yǎng)瓶或更大的塑料瓶。
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