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原理
將小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。
材料與儀器
孕鼠
PBS EDTA 胰酶 MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基 FBS 高糖DMEM
眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網(wǎng) 離心管 手術(shù)刀片
PBS EDTA 胰酶 MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基 FBS 高糖DMEM
眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網(wǎng) 離心管 手術(shù)刀片
步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
二、具體操作
1. 處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺(tái)中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開(kāi)，用另外一組剪刀、鑷子剪開(kāi)腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
1. 動(dòng)物
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 試劑
無(wú)Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械
眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng)、50 ml和15 ml離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
二、具體操作
1. 處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺(tái)中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開(kāi)，用另外一組剪刀、鑷子剪開(kāi)腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
2. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。
3. 用200 ul的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化。
4. 將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次。
5. 細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。
6. 3x106細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。
7. 24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
8. 細(xì)胞長(zhǎng)滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，作者一般不超過(guò)五分鐘)，按1:5傳代。
9. 細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF 100倍)
注意事項(xiàng)
1. 原代培養(yǎng)，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。
3. 凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞只能傳代一次，因?yàn)檫@些細(xì)胞繁殖能力有限。
4. 消化細(xì)胞時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)。
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