定量蛋白質(zhì)組學(xué)在當(dāng)代生命科學(xué)研究中扮演著關(guān)鍵角色，幫助研究人員深入了解生理或病理狀態(tài)下細(xì)胞系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。不同于僅關(guān)注蛋白種類的“鑒定”，蛋白質(zhì)定量的核心在于測量蛋白豐度的變化，從而揭示差異表達(dá)、翻譯后修飾及信號通路響應(yīng)等關(guān)鍵生物學(xué)現(xiàn)象。

目前，最常采用的兩類基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)定量策略為：無標(biāo)記定量（Label-Free Quantification, LFQ）與等重同位素標(biāo)記法（如Tandem Mass Tags, TMT；以及iTRAQ）。這兩種方法各具優(yōu)勢和局限，適用性依賴于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本類型及分析目標(biāo)。

Calvete, JJ. et al. Mass Spectrom Rev. 2024.

圖1. 不同定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略的綜合比較

一、非標(biāo)記定量 (LFQ)

無標(biāo)記定量是一種應(yīng)用廣泛的質(zhì)譜定量策略，通過測量LC-MS分析中肽段離子信號強(qiáng)度或譜圖計(jì)數(shù)來估算蛋白質(zhì)豐度。該方法基于一個(gè)核心假設(shè)：肽段的離子信號強(qiáng)度與其在樣本中的濃度成正比。在常規(guī)LFQ流程中，蛋白質(zhì)首先經(jīng)酶解為肽段，隨后通過液相色譜分離，并由高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行檢測。樣本間的定量比較通常依賴于軟件對保留時(shí)間的比對與信號強(qiáng)度的歸一化處理。

Sulaj E, et al, 2024.

圖2. LFQ定量工作流程

優(yōu)點(diǎn)：

1、無需化學(xué)標(biāo)記：不依賴外源標(biāo)簽，避免了標(biāo)記效率差異帶來的誤差。

2、成本較低：無需購買標(biāo)記試劑，適合大樣本量或預(yù)算有限的探索性研究。

3、樣本靈活性高：可直接用于體液、組織或FFPE樣本，無需特殊預(yù)處理。

4、廣泛動(dòng)態(tài)范圍：可捕捉從高豐度到低豐度蛋白的變化趨勢，適用于復(fù)雜生物樣本。

由于LFQ無需進(jìn)行化學(xué)或代謝標(biāo)記，具備成本低、操作靈活的優(yōu)勢，尤其適用于樣本數(shù)量較大或不適合進(jìn)行標(biāo)記的研究場景，如臨床組織或體液樣本。但該方法對批次間的分析波動(dòng)較為敏感，因此需要借助穩(wěn)健的數(shù)據(jù)歸一化與統(tǒng)計(jì)分析方法，以確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。

二、同位素標(biāo)記 (TMT/iTRAQ)

等重同位素標(biāo)記方法（如TMT和iTRAQ）通過將不同樣本來源的肽段共價(jià)連接上化學(xué)性質(zhì)相同但同位素組成不同的標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)定量。這些標(biāo)簽在質(zhì)譜一級掃描中表現(xiàn)為相同的前體離子質(zhì)量，但在MS/MS碎裂過程中可釋放出具有不同質(zhì)量的報(bào)告離子，從而實(shí)現(xiàn)多樣本間的相對定量。在標(biāo)記完成后，所有樣本混合并在一次LC-MS/MS分析中共同檢測，極大提高了實(shí)驗(yàn)效率和數(shù)據(jù)一致性。

圖3. TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)工作流程

優(yōu)勢：

1、高通量多重分析：一次可同時(shí)分析6–18個(gè)樣本，提高實(shí)驗(yàn)效率與一致性。

2、數(shù)據(jù)可比性強(qiáng)：所有樣本共上機(jī)，消除技術(shù)間變異，適用于時(shí)間梯度或組學(xué)分組設(shè)計(jì)。

3、定量精度高：定量比較在同一次運(yùn)行中完成，適合需要嚴(yán)格比較的差異分析項(xiàng)目。

4、適合復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：支持多個(gè)實(shí)驗(yàn)組、多個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)對比分析

等重標(biāo)記法的一大優(yōu)勢在于高通量多重分析（multiplexing）能力，可根據(jù)試劑類型實(shí)現(xiàn)6至18個(gè)樣本的同步定量，且具有較高的定量精度和較低的技術(shù)波動(dòng)，特別適用于對樣本間可比性要求較高的研究，如時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)或患者隊(duì)列分析。然而，該方法在MS2水平上定量時(shí)，容易受到共洗脫肽段的共隔離與共碎裂影響，導(dǎo)致比例失真（ratio distortion），因此在某些實(shí)驗(yàn)中需結(jié)合MS3或SPS-MS3等校正策略以提升定量準(zhǔn)確性。

三、使用場景對比：不同情況下該選哪種方法

1、異質(zhì)性臨床樣本的探索性蛋白質(zhì)組學(xué)研究 → 優(yōu)先選擇 LFQ

在早期的發(fā)現(xiàn)性研究中，常涉及來源復(fù)雜、樣本量有限的臨床樣本（如患者組織、血清、腦脊液等）。此類樣本通常難以進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，LFQ作為一種無需標(biāo)記的策略，可直接進(jìn)行分析，極大提高樣本適應(yīng)性。同時(shí)，LFQ具備較寬的動(dòng)態(tài)范圍，適合同時(shí)檢測高豐度與低豐度蛋白。但需特別注意歸一化與質(zhì)控流程，以保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

案例：Identifying potential biomarkers in plasma samples from a small cohort of disease and control subjects.

在2024年發(fā)表的一項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用Label-Free Quantification（LFQ）質(zhì)譜技術(shù)，系統(tǒng)分析了肥胖患者在接受利拉魯肽（liraglutide）治療前后的血漿蛋白表達(dá)變化。研究納入20例患者，比較治療前后血漿樣本，共鑒定出1,019個(gè)蛋白，其中151個(gè)為顯著差異蛋白，涉及糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞骨架等通路。研究發(fā)現(xiàn)，治療后多種炎癥和代謝相關(guān)蛋白顯著調(diào)控，提示利拉魯肽可能通過多通路改善代謝狀態(tài)。該研究充分展示了LFQ技術(shù)在異質(zhì)性臨床樣本、樣本量有限、標(biāo)記難度大的背景下的廣泛適用性和出色表現(xiàn)。與TMT等標(biāo)記方法相比，LFQ在此類早期探索性研究中操作更簡便、適應(yīng)性更強(qiáng)，并通過標(biāo)準(zhǔn)化歸一化流程有效保障了數(shù)據(jù)的可比性與定量準(zhǔn)確性。

圖4. 對PoT組和PT組肥胖患者的蛋白質(zhì)組學(xué)譜進(jìn)行多變量分析

圖5. 對已鑒定出顯著變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行火山圖、層次聚類 (HAC) 和熱圖分析

2、多種條件的大規(guī)模比較研究 → 推薦使用 TMT/iTRAQ

在需同時(shí)比較多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件或生物學(xué)重復(fù)的研究中，如藥物篩選、劑量梯度測試或時(shí)間序列分析，等重標(biāo)簽法具備顯著優(yōu)勢。TMT等方法可實(shí)現(xiàn)6至18個(gè)樣本在同一次LC-MS/MS運(yùn)行中共同分析，大幅降低批次效應(yīng)，提高定量一致性與效率。

案例： Expanding the landscape of aging via orbitrap astral mass spectrometry and tandem mass tag integration

在2025年發(fā)表于《Nature Communications》的這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合Orbitrap Astral高分辨質(zhì)譜儀與TMT 18-plex等重標(biāo)記技術(shù)，對不同年齡階段小鼠多組織樣本（皮質(zhì)層、海馬體、紋狀體和腎臟）進(jìn)行系統(tǒng)性蛋白質(zhì)組學(xué)分析。該研究通過單次LC-MS/MS運(yùn)行實(shí)現(xiàn)18個(gè)樣本的同步分析，顯著降低批次效應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)對超過12,000個(gè)蛋白的高深度、定量一致性分析。結(jié)果揭示了多組織中蛋白隨年齡變化的線性與非線性規(guī)律，特別是在大腦區(qū)域和腎臟中觀察到明顯的組織特異性與性別差異表達(dá)模式。該研究充分展示了TMT多重標(biāo)記策略在多條件、大規(guī)模比較研究中的優(yōu)勢，為衰老機(jī)制解析提供了重要的蛋白質(zhì)組學(xué)依據(jù)。

Keele, G.R. et al. Nat Commun. 2025.

圖6. 肽段過濾結(jié)合 Orbitrap Astral 可顯著提升TMT定量的準(zhǔn)確性

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