通過(guò)結(jié)構(gòu)仿生與功能整合，不僅為腸道感染機(jī)制研究提供了動(dòng)態(tài)平臺(tái)，還為抗菌藥物（尤其是噬菌體療法）的高通量篩選開(kāi)辟了新路徑，其核心優(yōu)勢(shì)在于三維結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的組織功能化與快速生理響應(yīng)能力，顯著提升了體外模型與體內(nèi)環(huán)境的一致性。

一、腸道感染建模實(shí)驗(yàn)步驟

1. 模型準(zhǔn)備與細(xì)菌培養(yǎng)

- 組織模型構(gòu)建：將Caco-2與HT29-MTX-E12細(xì)胞按6:1比例接種于V-ECM（絨毛-隱窩仿生界面）、F-ECM（平坦ECM界面），培養(yǎng)72小時(shí)形成完整上皮層。

- 細(xì)菌制備：使用大腸桿菌（E. coli）菌株（如ATCC BAA-2326™或ATCC 11303™），接種于LB瓊脂板37℃培養(yǎng)24小時(shí)，收集菌落并調(diào)整菌液濃度至OD???=0.01或0.1。

2. 感染模型建立與動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

- 感染接種：移除模型培養(yǎng)基，加入含大腸桿菌的培養(yǎng)基，共培養(yǎng)72小時(shí)，每24小時(shí)通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)菌與組織的互作（細(xì)菌用GFP標(biāo)記，細(xì)胞用CM-Dil染色）。

- 覆蓋面積分析：利用ImageJ軟件量化GFP標(biāo)記細(xì)菌在組織表面的覆蓋比例，對(duì)比V-ECM與對(duì)照組的差異。

- 屏障功能評(píng)估：通過(guò)電化學(xué)阻抗譜（EIS）測(cè)量跨上皮電阻（TEER），感染后TEER值的變化反映組織屏障完整性。V-ECM組在感染后TEER反而升高，而F-ECM組顯著下降。

3. 細(xì)菌定植與侵襲能力檢測(cè)

- 菌落計(jì)數(shù)（CFU）：收集培養(yǎng)介質(zhì)（浮游菌）和刮取組織表面（黏附菌），梯度稀釋后接種于LB平板，計(jì)算CFU/mL。V-ECM組黏附菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組。

- 侵襲實(shí)驗(yàn)：采用慶大霉素保護(hù)法，感染后用慶大霉素殺死胞外菌，裂解細(xì)胞后培養(yǎng)計(jì)數(shù)，評(píng)估細(xì)菌侵襲組織的能力。V-ECM組侵襲菌比例僅為0.1%，遠(yuǎn)低于F-ECM的3.7%。

4. 抗菌機(jī)制驗(yàn)證

- 抗菌肽（AMPs）檢測(cè)：通過(guò)ELISA測(cè)定感染后組織分泌的人β-防御素2（HBD2），V-ECM組感染后HBD2分泌量顯著升高。

- 基因表達(dá)分析：RT-PCR檢測(cè)AMPs相關(guān)基因（如DEFB4A、DEFB103B）及炎癥因子（IL-1α、TNF），V-ECM組AMPs基因上調(diào)，而對(duì)照組促炎基因激活。

- 黏膜屏障觀察：Alcian Blue染色顯示V-ECM組黏膜層覆蓋面積達(dá)81.28%，而F-ECM組僅11.32%，黏液層的完整性抑制了細(xì)菌黏附。

二、抗菌藥物篩選實(shí)驗(yàn)步驟

1. 耐藥菌感染模型構(gòu)建

- 耐藥菌制備：將大腸桿菌轉(zhuǎn)化為卡那霉素（Kan）耐藥株（如攜帶mini-Tn7-kan-gfp質(zhì)粒），調(diào)整OD???=0.1用于感染。

- 感染預(yù)處理：V-ECM模型培養(yǎng)72小時(shí)后，接種耐藥菌4小時(shí)，隨后更換含藥物的培養(yǎng)基。

2. 藥物處理與效果對(duì)比

- 藥物設(shè)置：實(shí)驗(yàn)組分為T(mén)4噬菌體組（10? PFU/mL）、Kan組（100 μg/mL）及對(duì)照組（無(wú)藥）。

- 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：每8小時(shí)取樣，熒光顯微鏡觀察細(xì)菌覆蓋面積，CFU計(jì)數(shù)評(píng)估細(xì)菌數(shù)量變化。T4噬菌體組24小時(shí)內(nèi)細(xì)菌覆蓋從84%降至接近0，而Kan組無(wú)明顯效果。

3. 噬菌體增殖與抗菌機(jī)制分析

- 噬菌斑檢測(cè)：收集T4噬菌體處理后的培養(yǎng)基，梯度稀釋后接種于雙層瓊脂，觀察噬菌斑形成。24小時(shí)后噬菌斑數(shù)量增加約100倍，表明噬菌體在感染部位增殖。

- 電鏡觀察：透射電鏡（TEM）顯示T4噬菌體吸附于細(xì)菌表面并導(dǎo)致菌體裂解，而Kan處理組細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)完整。

- 多重感染指數(shù)（MOI）：計(jì)算噬菌體與細(xì)菌的比例，T4組MOI在24小時(shí)內(nèi)從1:1升至10?:1，形成“自擴(kuò)增”抗菌效應(yīng)。

三、關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)勢(shì)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1. 模型性能對(duì)比

2. 創(chuàng)新點(diǎn)與應(yīng)用價(jià)值

- 快速篩選平臺(tái)：24小時(shí)內(nèi)完成抗菌效果評(píng)估，較傳統(tǒng)方法（需數(shù)周）大幅縮短周期。

- 仿生機(jī)制模擬：絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)促進(jìn)黏液層與AMP協(xié)同作用，更貼近體內(nèi)抗菌機(jī)制。

- 耐藥菌治療潛力：噬菌體在V-ECM模型中可自我擴(kuò)增，為AMR（抗微生物藥物耐藥性）感染提供新策略。

作者將 3D 仿生腸道絨毛模型應(yīng)用于腸道感染建模和抗菌藥物篩選。研究人員以大腸桿菌（E. coli）為模型病原體，比較了該模型與傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)模型在感染過(guò)程中的差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在仿生界面上培養(yǎng)的類(lèi)器官能夠有效抵抗大腸桿菌的感染。與對(duì)照組相比，其表面的細(xì)菌定植和生物膜形成明顯減少，這主要?dú)w因于類(lèi)器官分泌的天然抗菌肽（AMPs）水平升高。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，仿生界面的結(jié)構(gòu)特征促進(jìn)了杯狀細(xì)胞的分化和黏蛋白的分泌，形成了有效的黏膜屏障，從而抑制了病原體的黏附和入侵。

基于該模型的良好性能，研究人員還進(jìn)行了抗菌藥物篩選實(shí)驗(yàn)。他們比較了傳統(tǒng)抗生素卡那霉素和噬菌體 T4 對(duì)耐藥大腸桿菌的治療效果。結(jié)果顯示，噬菌體 T4 能夠在 24 小時(shí)內(nèi)顯著降低細(xì)菌數(shù)量，而卡那霉素則由于細(xì)菌耐藥性而效果不佳。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了該模型在抗菌藥物篩選中的實(shí)用性，也為耐藥菌感染的治療提供了新的思路。

四、實(shí)驗(yàn)拓展與未來(lái)方向

- 微流控整合：將V-ECM模型接入英國(guó)Kirkstall Quasi Vivo器官芯片（OoC），模擬腸道蠕動(dòng)流場(chǎng)，評(píng)估動(dòng)態(tài)剪切力對(duì)感染與藥物效果的影響。

- 共培養(yǎng)系統(tǒng)：構(gòu)建英國(guó)Kirkstall Quasi Vivo雙腔器官芯片（OoC），上層腸道組織+下層血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究病原體跨屏障侵襲與免疫細(xì)胞互作。

- 原代類(lèi)器官驗(yàn)證：使用患者來(lái)源的腸道類(lèi)器官（hIOs）接種于V-ECM，提升模型臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

附：超47億元！國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)2025年項(xiàng)目申報(bào)指南發(fā)布（以下摘自2025.6.30“科獎(jiǎng)中心”）

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