一、背景

尼氏染色試劑盒(甲基紫法)主要由甲基紫染色液、分化液等組成。尼氏物質呈紫黑藍色,神經(jīng)元呈淡紫藍色,細胞核呈紫藍色。

神經(jīng)元細胞體包括一個具有皺褶核膜的大細胞核、稀疏的染色質和一個明顯的核仁。在細胞體中細胞質是尼氏顆粒，即能夠代表粗面內質網(wǎng)并在很多神經(jīng)元中產(chǎn)生特異的斑點狀嗜堿性表現(xiàn)的嗜堿性顆粒。

尼氏顆粒可以用很多染色來顯示如中性紅、亞甲基藍、甲苯胺藍和甲基紫等。染色的變異、pH和分化的時間使一些染色既可以僅突出尼氏物質，也可以顯示神經(jīng)元的細胞核和神經(jīng)膠質。

尼氏體(Nissl body)或稱尼氏小體是分布于神經(jīng)細胞胞質內的三角形或橢圓形小塊狀物質，能被堿性染料如硫堇、亞甲藍、甲苯胺藍和焦油紫等染料染成紫藍色。各種神經(jīng)細胞內都含有尼氏體，但其形狀、數(shù)量、分布位置常常不同。

尼氏體也存在于樹突中，但不在于軸突和包體的軸丘。尼氏體會因為生理狀態(tài)的變化而變化，尼氏體是神經(jīng)元內合成蛋白質合成的重要部位，當神經(jīng)元受到刺激后，包體內的尼氏體會明顯減少。

二、自備材料

1、中性福爾馬林溶液

2、顯微鏡

3、蒸餾水

三、參考操作

1、固定:可采用乙醇、Carnoy固定液或中性福爾馬林溶液。

2、組織切片:石蠟切片7-10μm或25μm(見注意事項4)。

3、切片脫蠟入水。

4、用甲基紫染色液涂片，染色10-20min。

5、蒸餾水沖洗。

6、用Nissl Differentiation分化4-8s，直到大部分染色被消除。

四、應用

尼氏染色試劑盒(甲基紫法)可以用于神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的研究：

大鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及慢病毒介導GFP轉染的實驗研究目的原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，并在體外繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，慢病毒介導GFP轉染神經(jīng)干細胞后，可做為移植的種子細胞，滿足細胞移植需要。

材料與方法：以健康孕15天Wistar大鼠為實驗動物，體外分離并原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，之后傳代培養(yǎng)，并進行單細胞克隆實驗。免疫熒光法和免疫組化SP法對神經(jīng)干細胞分進行鑒定，Lentivirus介導轉染NSCs。

結果：1、原代培養(yǎng)細胞可形成數(shù)十個細胞聚集而成的小神經(jīng)球(Neurosphere)神經(jīng)球逐漸增大，7天時神經(jīng)球已生長成為數(shù)百個細胞的大克隆，即可傳代培養(yǎng)。傳代第7天時已再次長成為數(shù)百個細胞聚集的大克隆，將細胞連續(xù)傳代，細胞的生長模式基本相同。

2、原代培養(yǎng)的神經(jīng)球經(jīng)分散﹑再擴增得到的大量神經(jīng)球呈nestin抗原陽性；神經(jīng)球可以分化為三種細胞，免疫熒光法和免疫組化SP法檢測三種細胞分別呈NSE、CNP、GFAP陽性。

3、慢病毒介導GFP轉染NSCs后，熒光顯微鏡下觀察，可見NSCs攜帶綠色熒光。

結論：1、從大鼠胚胎(孕15天)腦組織中分離的神經(jīng)干細胞在體外可繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，可滿足細胞移植需要。

2、慢病毒介導GFP轉染神經(jīng)干細胞，標記后的神經(jīng)干細胞做為移植的種子細胞，便于在動物體內進行跟蹤研究。

NSCs移植治療大鼠血管性癡呆的實驗研究目的將慢病毒介導GFP標記的NSCs通過海馬立體定向注射的方法移植到血管性癡呆模型大鼠，使海馬周圍的NSCs數(shù)量增加，用Morris水迷宮檢測系統(tǒng)對實驗大鼠作定位航行試驗和空間探索實驗測試，檢測大鼠的學習記憶能力的改變，觀察NSCs移植的治療效果。

材料與方法：月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來制備血管性癡呆2VO模型；傳代至第6代的Wistar大鼠神經(jīng)干細胞，GFP標記后于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對假手術組、對照組、NSCs移植組海馬組織切片做尼氏染色，觀察病理學改變；在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）時對移植前后各組大鼠行Morris水迷宮測試，對定位航行實驗和空間探索實驗結果進行統(tǒng)計分析。

結果：1、神經(jīng)干細胞移植1周后，大鼠海馬區(qū)冰凍切片顯示有綠色熒光存在，證明神經(jīng)干細胞可在海馬區(qū)域存活、增殖。

2、缺血4周時（移植前），NSCs移植組與對照組大鼠各項指標均無顯著性差異，但二者與假手術組相比均有顯著性差異。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）時，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期較對照組均明顯縮短（P<0.05），但與假手術組相比仍明顯延長；NSCs移植組穿越平臺區(qū)次數(shù)較對照組也明顯增加（P<0.05），與假手術組相比仍明顯減少(P<0.01)；NSCs移植組大鼠平臺所在象限停留的時間百分比較對照組明顯增加（P<0.05，移植后12周除外），但與假手術組相比仍明顯減少(P<0.05)。

3、NSCs移植組尼氏染色顯示神經(jīng)元丟失、變性情況較對照組有明顯改善，神經(jīng)元細胞形態(tài)較完整，胞漿內尼氏小體相對較豐富。結論神經(jīng)干細胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠學習記憶能力。

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