在納米顆粒表征領(lǐng)域，粒徑、濃度與電位等參數(shù)的精準(zhǔn)測定是確保研究和應(yīng)用成功的核心要素。前期文章我們曾詳細分享過「納米顆粒檢測中的常見參數(shù)」。精確獲取這些參數(shù)，不僅有助于深入解析納米材料的物理化學(xué)特性，還為其在生物醫(yī)藥、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供了關(guān)鍵依據(jù)。然而，測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性、重復(fù)性與再現(xiàn)性僅依靠先進的儀器設(shè)備本身是不夠的，還需要通過一套嚴(yán)格的驗證流程來保障儀器的性能和操作的規(guī)范。這便是3Q認證 (IQ、OQ、PQ) 在納米顆粒表征中的重要性所在。

01

3Q認證的內(nèi)容及意義

在納米顆粒表征領(lǐng)域，3Q認證不僅規(guī)范了儀器的安裝與運行，還通過系統(tǒng)化驗證流程確保數(shù)據(jù)的科學(xué)性和可重復(fù)性。本文將詳細解讀3Q認證的核心內(nèi)容及其在納米顆粒表征中的具體實施內(nèi)容，探討如何通過嚴(yán)格的驗證體系提升儀器的可靠性，助力納米科學(xué)及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的高質(zhì)量發(fā)展。

• 文件審核：檢查儀器的安裝手冊、用戶手冊、維護手冊等文件是否齊全。核對儀器的名稱、型號、序列號等基本信息，確保與采購清單一致。確認儀器的安裝環(huán)境是否符合設(shè)計要求，包括溫度、濕度、電源等。
• 安裝環(huán)境確認：確保安裝地點的環(huán)境條件（如排風(fēng)、溫濕度控制、電力供應(yīng)等）符合儀器的運行要求。檢查儀器的電氣安全、機械安全和環(huán)境安全是否符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
• 儀器部件確認：核對儀器的各個部件是否安裝正確，連接是否牢固。確認儀器的校準(zhǔn)和調(diào)試是否完成，所有功能是否正常。

納米顆粒檢測設(shè)備屬于精密的測量儀器，測試數(shù)據(jù)關(guān)乎后續(xù)的一系列科研生產(chǎn)工作。通過嚴(yán)謹?shù)腜Q認證，基本可確定儀器的檢測能力，對日后如何正確看待該儀器的測試數(shù)據(jù)有重要的指導(dǎo)意義。對于精密的表征儀器，PQ認證又包括哪幾方面的實驗驗證內(nèi)容呢？接下來，我們將深入探討PQ認證中的各項關(guān)鍵實驗及其對數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響。

02

有關(guān)PQ驗證的關(guān)鍵參數(shù)

根據(jù) ICH Q2(R2) ，精密度又可分為以下三類：

• 重復(fù)性 (Repeatability) ：在相同實驗室、相同操作員、相同儀器、相同條件下進行的短時間內(nèi)重復(fù)測量所得結(jié)果的精密度。以顆粒濃度檢測為例，建議 (a) 設(shè)置至少9次測試，即3個不同濃度，每個濃度重復(fù)3次；或者 (b) 對某一固定測試濃度至少重復(fù)測試6次來評估重復(fù)性。
• 中間精密度 (Intermediate Precision)：在同一實驗室，但不同操作員、不同時間或不同儀器條件下進行的測量所得的精密度。具體的驗證實驗范圍，需要驗證者根據(jù)實際應(yīng)用場景確定。換句話說，不是所有情況下都需要逐一單獨測試每個變量，也不一定要全面測試所有變量，而是要根據(jù)實際需求，評估可能影響測量精密度的隨機因素，并根據(jù)生產(chǎn)開發(fā)和風(fēng)險評估進行驗證實驗設(shè)計。根據(jù)不同評估因素和實驗設(shè)計，中間精密度又包括日間精密度（不同的測試日期），室間精密度（不同的環(huán)境條件：溫濕度變化、振動、氣流等），人員精密度（不同操作者），設(shè)備間精密度（不同儀器或不同批次的儀器），批間/批內(nèi)精密度（批次間或同一批次內(nèi)的樣本）等。
• 再現(xiàn)性 (Reproducibility)：在不同實驗室或不同環(huán)境下，由不同人員使用相同的方法測量所得結(jié)果的精密度。在大多數(shù)情況下，監(jiān)管機構(gòu)（如 FDA、EMA）通常不會強制要求提交再現(xiàn)性測試的數(shù)據(jù)，但在以下情況下，還是需要考慮進行這類測試：(a) 標(biāo)準(zhǔn)化分析方法（如要把某個檢測方法納入藥典）。 (b) 多個實驗室共同使用（如跨地區(qū)或跨機構(gòu)的實驗室都要使用相同的方法時）。

變異系數(shù) (Coefficient of Variation, CV) 是衡量數(shù)據(jù)離散程度的一個統(tǒng)計指標(biāo)，表示為數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差相對于平均值的比例（因此有時也稱為相對標(biāo)準(zhǔn)差，RSD），可以直觀地比較不同儀器或不同測量條件下的穩(wěn)定性。它是一個無量綱的指標(biāo)，通常以百分比表示。CV值越小，離散程度低越，說明測量結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性越好，精密度越高。變異系數(shù)的計算公式為：

• LOD：分析方法或儀器能夠可靠檢測到目標(biāo)物存在的量值（粒徑、濃度、電位等）但不要求該信號能被準(zhǔn)確量化。LOD 代表了檢測方法的靈敏度下限，同時對痕量分析至關(guān)重要。

• LOQ：可以定量測量分析物的檢測范圍下限。分析方法或儀器能夠可靠且準(zhǔn)確測量目標(biāo)物的量值（粒徑、濃度、電位等），要求測量值具有足夠的準(zhǔn)確度和精密度。LOQ 設(shè)定時，需要滿足CV% ≤ 10%（或更嚴(yán)格要求）。

線性 (Linearity) 指的是分析方法在特定濃度范圍內(nèi)，檢測信號（響應(yīng)值）與被測物質(zhì)的濃度或數(shù)量之間呈現(xiàn)線性關(guān)系的能力。簡言之，當(dāng)樣品濃度或粒子數(shù)量在一定范圍內(nèi)變化時，測量結(jié)果應(yīng)當(dāng)成比例地變化。線性良好的方法具有較高的線性相關(guān)系數(shù) (Correlation Coefficient, R²)，R²越接近1，線性關(guān)系越好。通常一組數(shù)據(jù)的R²≥ 0.8才被認為具有相關(guān)性；而要保證數(shù)據(jù)的可靠性，往往要求 R²≥ 0.99（或參考具體行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）。

線性區(qū)間（Linearity Range或Linear Region） 是指在特定濃度或粒子數(shù)量范圍內(nèi)，檢測方法保持線性關(guān)系的最大范圍。低于線性區(qū)間下限，信號可能低于儀器LOD，無法可靠檢測；高于線性區(qū)間上限，則可能出現(xiàn)信號飽和，儀器無法正確響應(yīng)或者出現(xiàn)非線性效應(yīng)。在PQ過程中，也需要驗證分析方法或儀器的線性區(qū)間，通常采用以下實驗方法：

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 (Calibration Curve Method)：使用不同濃度或不同粒子數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品進行測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實驗步驟如下：

1. 準(zhǔn)備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本，可以是有理論標(biāo)稱濃度的標(biāo)準(zhǔn)微球或已知濃度的其他實際樣本。不同的濃度設(shè)置通常采用對初始樣本進行連續(xù)或倍比稀釋來制備。（ICH建議在整個范圍內(nèi)至少適當(dāng)分布5個濃度 ^[2] 。）

2. 使用待測方法分別對每個樣品進行測量，記錄檢測信號（如吸光度、熒光強度、峰面積等）或量值（直接的濃度賦值等）。

3. 繪制檢測信號/量值 (y) 與預(yù)期濃度 (x) 的散點圖。

4. 通過線性回歸分析擬合直線，計算斜率 (k) 、截距 (b) 和相關(guān)系數(shù) (R²) 。

5. 根據(jù)R²和回收率驗證標(biāo)準(zhǔn)（通常要求偏差在±10%以內(nèi)）確定線性區(qū)間。

• 線性回歸法 (Linear Regression Method)：若待測樣本的濃度未知，則以該樣本原液濃度為最高濃度，用相同的緩沖液體系連續(xù)稀釋（或從原液倍比稀釋）4-5個濃度梯度，實施上述標(biāo)準(zhǔn)曲線法。區(qū)別在于將預(yù)期濃度調(diào)整為各濃度梯度樣本稀釋倍數(shù)的倒數(shù) (1/N Dilution factor)。繪制濃度測量值（或梯度各點的濃度均值）與對應(yīng)稀釋比之間的線性回歸擬合直線，并評估R²（如下圖）。此方法為分析驗證中較常采用的方法之一。

混合NIST標(biāo)準(zhǔn)微球樣本的濃度線性

• 加標(biāo)回收率法 (Spiked Recovery Method)：類似于準(zhǔn)確度驗證中的加標(biāo)實驗，分析步驟如下：

1. 在空白基質(zhì)中加入已知濃度的目標(biāo)分析物，制備一系列加標(biāo)樣品。

2. 使用待測方法對加標(biāo)樣品進行測量，記錄檢測信號或直接量值，計算回收率。

3. 根據(jù)回收率（通常要求80%-120%）和線性回歸分析結(jié)果確定線性區(qū)間 ^[6]。

值得注意的是，線性區(qū)間與檢測范圍有一定區(qū)別：

專屬性即分析方法在測定目標(biāo)物時，是否能避免其他物質(zhì)的干擾，從而準(zhǔn)確地識別或定量目標(biāo)物。專屬性驗證往往是分析方法驗證中需要首先考慮的驗證內(nèi)容之一，它關(guān)乎是否選擇了適用的檢測方法。納米顆粒表征穩(wěn)健性驗證常常采用加標(biāo)實驗的方法來進行干擾測試：

1. 在待測樣本基質(zhì)中摻入一定量當(dāng)前方法不敏感的樣本或雜質(zhì)，如不適用該檢測方法的樣本或在檢測范圍以外的干擾樣本。通過比較加入干擾樣本前后的數(shù)據(jù)變化，檢驗該摻入是否影響檢測結(jié)果。例如，某設(shè)備檢測量程為50-200 nm，在待測樣本中加入已知粒徑較小 (20-30 nm) 的標(biāo)準(zhǔn)微球或蛋白質(zhì)顆粒溶液，分別檢測含有添加物的樣本和不含添加物樣本的粒徑和濃度，從而判斷該設(shè)備是否適用于此類樣本的表征。

2. 在待測樣本中加入已知量的內(nèi)標(biāo)，測量待測樣本的同時，評估設(shè)備對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測響應(yīng)是否符合理論預(yù)期，驗證不同尺寸顆粒混合后的分布測量是否準(zhǔn)確。例如，在外泌體 (exosomes) 樣本（通常粒徑范圍在30-150 nm）中加入等量（相同顆粒濃度）粒徑150 nm的CRM微球內(nèi)標(biāo)，檢測加入內(nèi)標(biāo)后樣本的粒徑和濃度與加標(biāo)前的變化。若可以檢測到相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)信號，同時加標(biāo)后混合物的平均粒徑值與理論粒徑均值相符（回收率在接受范圍內(nèi)），濃度值不變，則可判斷該檢測方法對該外泌體樣本的具有專屬性。該實驗特別適用于評估儀器對多分散體系 (polydisperse system) 樣本的檢測能力。

穩(wěn)健性（也稱耐用性）是指分析方法在小范圍實驗條件變化（如溫度、pH、試劑濃度等）下，仍能維持測定結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。它衡量方法對輕微環(huán)境波動的耐受能力。此外，穩(wěn)健性測試還可以用于評估樣品制備和試劑的穩(wěn)定性，確保在整個實驗過程中數(shù)據(jù)不會因這些因素的變化而受影響。通俗地說，就是提前評估檢測方法的“抗干擾能力”，確保它在現(xiàn)實實驗條件下（非理想條件下）也能正常工作。穩(wěn)健性測試的結(jié)果可以在方法開發(fā)階段作為參考數(shù)據(jù)提交，或者在監(jiān)管機構(gòu)要求時提供。

03

結(jié)語

參考文獻：

1.國家市場監(jiān)督管理總局. (2020). 《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）》.

2.International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). (2023). Validation of Analytical Procedures Q2(R2).

3.U.S. Food and Drug Administration (FDA). (2011). Process Validation: General Principles and Practices.

4.International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). ICH Q7: Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients[S]. 2016.

5.USP General Chapter <1058>: Analytical Instrument Qualification[S]. United States Pharmacopeia, 2023.

6.U.S. Food and Drug Administration (FDA). Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry[S]. 2018.

7.《中國藥典2020版》——9101分析方法驗證指導(dǎo)原則