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一、適用場(chǎng)景
乳膠微球表面帶有羧基功能基團(tuán)，可通過(guò)EDC介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)與含有氨基的蛋白或多肽形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)蛋白與微球的共價(jià)偶聯(lián)。
適用條件:
蛋白穩(wěn)定性高、不易變性；
蛋白含氨基數(shù)量較少；
操作簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
二、基本原理
1.反應(yīng)機(jī)制：
乳膠微球表面的羧基先與 EDC 反應(yīng)生成活化的酯中間體，再與蛋白上的伯氨基反應(yīng)生成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)共價(jià)偶聯(lián)。
2.反應(yīng)環(huán)境：
pH 為4.5–6.0（弱酸性環(huán)境）。
3.注意事項(xiàng)：
若蛋白同時(shí)含多個(gè)氨基和羧基，過(guò)量 EDC 可能導(dǎo)致蛋白交聯(lián)失活，可使用羧基乳膠微球兩步法共價(jià)法偶聯(lián)蛋白調(diào)整方案。
三、注意事項(xiàng)
1. 緩沖體系：
禁用含氨基的緩沖液（如Tris緩沖液），推薦使用MES緩沖體系。
2. EDC適用規(guī)范:
防潮處理：使用前將EDC試劑瓶置于干燥器中升溫至室溫至少 30 分鐘，避免水汽進(jìn)入。
現(xiàn)用現(xiàn)配：EDC 水溶液半衰期短，需臨用前配制。
3.抗體預(yù)處理：
抗體需不含 BSA 等蛋白類(lèi)穩(wěn)定劑及 Tris 等氨基緩沖鹽，若含此類(lèi)成分，需通過(guò)離心脫鹽、超濾純化去除。
高比例甘油可能影響偶聯(lián)效率，建議預(yù)先去除。
四、基本流程（1 mg 蛋白偶聯(lián)至 10 mg 微球）
1. 配制緩沖液
反應(yīng)緩沖液（R Buffer）：50 mM MES，pH 5.0（分出 2 mL 冰浴冷卻）。
封閉緩沖液（B Buffer）：50 mM HEPES，pH 7.4，1%（w/v）BSA。
儲(chǔ)存緩沖液（S Buffer）：50 mM HEPES，pH 7.4，1%（w/v）BSA，05%（w/v）Proclin® 300。
2. 微球預(yù)處理
將微球分散液混勻并平衡至室溫，按固含量取 10 mg 微球至 2 mL 圓底離心管，用 R Buffer 稀釋至1% w/v固含量。 例：若微球固含量為 10% w/v，取 1 mL 分散液 + 0.9 mL R Buffer；若為 5% w/v，取 0.2 mL 分散液 + 0.8 mL R Buffer。
3. 蛋白孵育
加入 1 mg 蛋白，顛倒混勻后，于 25℃混勻儀孵育 30 分鐘。
4. 配制 EDC 溶液
稱(chēng)取 10–20 mg EDC 固體，用冰浴 R Buffer 溶解至濃度10 mg/mL（≈52 mM）。
5. 加入 EDC 溶液
按羧基總量的 5 倍摩爾比加入 EDC 溶液，充分混勻。 計(jì)算示例：若微球羧基密度為 100 μEq/g，10 mg 微球含羧基 1000 nmol，需 EDC 1500 nmol，對(duì)應(yīng) 52 mM 溶液體積為 30 μL。
6. 反應(yīng)與清洗
25℃混勻儀反應(yīng) 2–4 小時(shí)，結(jié)束后 5000×g 離心 10 分鐘（若未沉淀，增大離心力或延長(zhǎng)時(shí)間）。
棄上清，加 5 mL R Buffer 重懸沉淀，重復(fù)清洗 3 次。
7. 封閉反應(yīng)
加 5 mL B Buffer 初步重懸微球，冰浴下用探頭式超聲破碎儀（功率 200 W，超聲 5 s / 間隙 5 s，總時(shí)長(zhǎng) 10–15 分鐘）充分打散。
25℃混勻儀封閉反應(yīng)過(guò)夜。
8. 儲(chǔ)存
離心棄上清，加 5 mL S Buffer 超聲打散，4℃保存?zhèn)溆茫x心轉(zhuǎn)速和時(shí)間需根據(jù)微球粒徑調(diào)整）。
五、常見(jiàn)問(wèn)題
Q1：如何選擇合適粒徑的微球？
線(xiàn)性范圍優(yōu)先：選擇小粒徑微球（比表面積大，偶聯(lián)抗體量多）。
靈敏度優(yōu)先：選擇大粒徑微球（凝集時(shí)粒徑變化顯著，濁度信號(hào)高）。
Q2：如何判斷微球是否打散？
方法：將微球用去離子水或 R Buffer 稀釋至 1% w/v（粒徑＞200 nm時(shí)稀釋至 0.05% w/v），測(cè)定 570 nm 吸光度（A0）。
對(duì)比：包被蛋白后，稀釋至相同濃度測(cè)定吸光度（A1）。若 A1接近或略高于 A0，說(shuō)明已打散；若A1遠(yuǎn)高于A0，可能為不可逆凝集，需降低微球濃度、調(diào)整EDC用量或改用兩步法。
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