在現(xiàn)代生命科學(xué)中，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)——即其氨基酸序列——早已不再被視為靜態(tài)的分子代碼。它不僅決定蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和功能特性，更深刻影響細胞行為、信號通路動態(tài)、甚至進化路徑與疾病機制。由此，獲取蛋白質(zhì)準確序列，成為深入理解其生物學(xué)功能與作用機制的起點。

不同于傳統(tǒng)“蛋白鑒定”中的“歸類識別”，蛋白測序（Protein Sequencing）關(guān)注的是完整而連續(xù)的氨基酸信息，用于解析未知蛋白、識別序列突變、確認藥物蛋白一致性或追蹤翻譯后修飾等關(guān)鍵科研任務(wù)。在生物藥開發(fā)、個體化醫(yī)學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、抗體工程等高精度領(lǐng)域，蛋白測序技術(shù)的精細化能力日益成為研究和應(yīng)用決策的關(guān)鍵技術(shù)杠桿。

一、蛋白測序 ≠ 蛋白鑒定

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，“測序”“鑒定”等術(shù)語常被交替使用，導(dǎo)致術(shù)語誤用、技術(shù)選擇失誤甚至研究假設(shè)混淆。

從定義上講，蛋白測序是指對蛋白質(zhì)進行氨基酸序列解析的過程，旨在重建其一級結(jié)構(gòu)的連續(xù)排列，通常以N端到C端的方向表示全部或部分氨基酸序列。其目標是獲取“序列本體”，而非僅判斷蛋白的“存在性”或“類別歸屬”。

相比之下：

蛋白鑒定（Protein Identification）：依賴質(zhì)譜-數(shù)據(jù)庫匹配，確定某一肽段是否“屬于”某已知蛋白。它是分類式的“歸屬判斷”，而非逐位點的信息重建。

二、蛋白測序技術(shù)的演化

1、Edman 降解：高精度線性識別的開端?

Edman 降解由 Pehr Edman 于20世紀50年代建立，是蛋白質(zhì)序列解析的shǒu cì化學(xué)實現(xiàn)。該方法基于苯異硫氰酸（PITC）對N端氨基酸的專一性反應(yīng)，通過順序性標記與切除，在每一輪循環(huán)中釋放并鑒定一個PTH-氨基酸，進而實現(xiàn)線性序列重建。

圖1. Edman降解法示意圖

Edman法的突出優(yōu)點是：單個氨基酸級別的識別精度jí gāo，誤差可控，但缺點也很明顯：

● 僅適用于具有游離N端的純化樣品；

● 序列長度受限，通常不超過30-50殘基；

● 無法處理混合物或修飾蛋白。

盡管如此，它在現(xiàn)代蛋白藥物與合成肽驗證中仍具dú tè優(yōu)勢，如合成肽質(zhì)量驗證、重組蛋白N端信號肽切除效率評估、以及生物制品結(jié)構(gòu)一致性評估等。

2、Bottom-up 質(zhì)譜策略：高通量測序的技術(shù)中樞

質(zhì)譜技術(shù)的引入，是蛋白測序發(fā)展中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點。Bottom-up 策略將蛋白質(zhì)通過特異性蛋白酶（如胰蛋白酶）酶解為短肽段，通過LC-MS/MS對肽段進行碎裂與檢測，再借助數(shù)據(jù)庫比對或de novo算法重建蛋白質(zhì)序列。

Kellie, J. F. et al. Mol Biosyst. 2010.

圖2. 自下而上和自上而下策略對比示意圖

該策略具備良好的通量、覆蓋度與適配性，已成為目前zuì guǎng泛應(yīng)用的蛋白測序方法。然而，Bottom-up 本質(zhì)上是一種間接的序列推導(dǎo)方式，其測序能力存在以下結(jié)構(gòu)性限制：

● 序列上下文信息缺失，影響跨肽段修飾重建；

● 修飾定位依賴碎片完整性，存在識別歧義；

● 對于高度異構(gòu)蛋白、融合蛋白或非模式生物蛋白，de novo測序仍面臨準確率瓶頸。

盡管如此，Bottom-up 的策略在蛋白組學(xué)、抗體序列初篩、生物藥殘留分析等場景中仍是不可替代的核心工具。

3、Top-down 質(zhì)譜策略：整分子結(jié)構(gòu)識別的深入拓展

Top-down 測序策略跳過酶解步驟，直接將完整蛋白質(zhì)送入高分辨率質(zhì)譜系統(tǒng)，通過高能碎裂（如ETD、HCD、EThcD）解析其多級碎片離子，實現(xiàn)對一級結(jié)構(gòu)的整分子解析。

Kellie, J. F. et al. Mol Biosyst. 2010.

圖3. 自上而下策略原理示意圖

該方法可在不破壞蛋白天然修飾組合的前提下，提供精確的序列與修飾定位信息，特別適用于：

● 蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）識別；

● 等電點異構(gòu)體區(qū)分；

● 生物藥質(zhì)量屬性評估。

Top-down 的主要技術(shù)挑戰(zhàn)包括：

● 高分子量蛋白碎片圖譜解析難度大；

● 對質(zhì)譜平臺分辨率、離子累積能力要求jí gāo；

● 樣本純度、穩(wěn)定性需嚴格控制。

盡管其在通量和樣品適應(yīng)性方面不及 Bottom-up，Top-down 在某些研究方向卻不可替代，尤其是在需要保證結(jié)構(gòu)連續(xù)性、修飾組合保真性、異構(gòu)體清晰分離的情境下。例如抗體CDR區(qū)的微突變識別、PTM互作網(wǎng)絡(luò)的建立、以及某些生物藥的結(jié)構(gòu)一致性備案等。

4、單分子蛋白測序的興起

傳統(tǒng)質(zhì)譜測序策略均建立在肽段碎裂與譜圖反演重建的邏輯基礎(chǔ)之上。這種方法雖然成熟、通量高、適應(yīng)性強，但其依賴片段信息進行反推的過程，天然存在分辨歧義、修飾丟失和鏈內(nèi)關(guān)聯(lián)缺失等局限性。近年來，研究者開始嘗試發(fā)展無需酶解、無需拼接、可直接讀取氨基酸順序的單分子測序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）技術(shù)。這類技術(shù)的核心理念是：在不破壞蛋白整體結(jié)構(gòu)的前提下，實現(xiàn)對單個分子的逐殘基識別。

Restrepo-Pérez, L. et al. Nature Nanotech. 2018.

圖4. 單分子蛋白測序基本流程與主要技術(shù)路徑

（1）納米孔測序（Nanopore-Based Sequencing）

納米孔測序策略依托于生物或固態(tài)孔道的亞納米級空間分辨能力，將蛋白質(zhì)或短肽分子引導(dǎo)通過孔道通道，在此過程中監(jiān)測穿孔分子的阻抗變化（ionic current blockade）。不同氨基酸殘基的體積、電荷與疏水性等性質(zhì)影響其在孔道中的空間占據(jù)與局部電流擾動，從而產(chǎn)生特征信號。

● 代表平臺：Oxford Nanopore；

● 技術(shù)優(yōu)勢：理論上可在不拆分蛋白結(jié)構(gòu)的條件下獲取線性序列信息；

（2）熒光法測序（Fluorescence-Based Sequencing）

熒光測序方法通過對特定氨基酸類型引入可識別的熒光標記團，并將肽鏈固定于表面載體。隨后，采用順序化學(xué)處理或酶促降解逐步移除殘基，同時利用高靈敏度多通道熒光成像系統(tǒng)記錄每個周期所釋放信號的光譜特征，從而推導(dǎo)殘基順序。

● 代表平臺：Quantum-Si、Alamar Biosciences；

● 技術(shù)優(yōu)勢：理論上可應(yīng)用于復(fù)雜背景中的微量樣本，支持特定氨基酸的高特異性識別；

蛋白測序缺乏模板依賴、具有天然異質(zhì)性、并常伴隨多重翻譯后修飾，其測序結(jié)果通常不具有wéi yī性，而是建立在實驗策略、物理分辨率與數(shù)據(jù)模型之間動態(tài)權(quán)衡的基礎(chǔ)上。本文梳理的幾類測序技術(shù)路徑，從化學(xué)降解到質(zhì)譜分析，再到單分子水平的直接讀取，實質(zhì)上構(gòu)成了一套彼此補償?shù)男畔@取體系。這些方法并非相互替代，而是在面對不同研究目標與樣本約束條件下，為實現(xiàn)結(jié)構(gòu)精確性、序列覆蓋率與修飾還原度之間的平衡提供了策略支持。

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