一、實(shí)驗(yàn)材料

1、樣本來源：人腦組織（通常來源于手術(shù)切除的皮質(zhì)灰質(zhì)區(qū)域，需符合倫理規(guī)范）。

2、試劑

PBS（含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml）

膠原酶（1 mg/ml）和DNaseⅠ（10 μg/ml）混合消化液

250 g/L牛血清白蛋白（BSA）

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM或特制培養(yǎng)基）

3、耗材

眼科剪、鑷子

不同孔徑尼龍篩（60 μm、150 μm、230 μm）

離心管（15 ml、50 ml）

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1、組織處理

將人腦組織置于預(yù)冷的PBS中，去除腦膜及表面大血管，保留皮質(zhì)灰質(zhì)。

使用勻漿機(jī)將灰質(zhì)組織制成勻漿，以釋放微血管片段。

2、酶消化

加入含膠原酶和DNaseⅠ的消化液，37℃消化1小時(shí)，隨后離心去除上清中的脂肪碎片和髓磷脂。

將沉淀重新懸浮于消化液中，繼續(xù)消化1-3小時(shí)以充分解離微血管。

3、分級(jí)過濾

消化產(chǎn)物依次通過230 μm和150 μm尼龍篩，去除大血管和碎片。

濾液通過60 μm尼龍篩，收集截留的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并用培養(yǎng)基沖洗至培養(yǎng)皿中。

4、純化與培養(yǎng)

使用250 g/L BSA梯度離心（4000 rpm，10分鐘）進(jìn)一步純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

將細(xì)胞重懸于含特制添加劑的培養(yǎng)基（如原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基），接種至多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

樣本新鮮度：人腦組織需盡快處理（建議在2小時(shí)內(nèi)），避免細(xì)胞活性下降。

污染控制：嚴(yán)格無菌操作，并在PBS中添加抗生素防止微生物污染。

酶消化優(yōu)化：膠原酶濃度和消化時(shí)間需根據(jù)組織特性調(diào)整，過長可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

純度驗(yàn)證：可通過免疫熒光染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞純度。

四、與動(dòng)物模型方法的差異

組織處理：人腦組織通常更致密，需更長時(shí)間消化（動(dòng)物模型多采用30-45分鐘）。

篩網(wǎng)選擇：動(dòng)物模型多用離心法分層，而人源細(xì)胞依賴分級(jí)過濾。

培養(yǎng)基：人源細(xì)胞常需添加特制生長因子，而大鼠BMEC可用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

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