一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

hPSC誘導(dǎo)分化內(nèi)耳類器官試劑盒（abs90132-1kit）

產(chǎn)品組成：

2、輔助試劑

3、實(shí)驗(yàn)耗材

 二、誘導(dǎo)流程圖

三、試劑盒使用流程

①EB 形成（2 天）
1、hPSC 于基質(zhì)膠包被的六孔板的一個(gè)孔，用Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖至 70-80%匯合度。
2、吸去Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
3、孔中加入 1mL PBS（無鈣鎂離子）洗，吸去。
4、孔中加入 1mL 人多能干細(xì)胞消化液，37℃消化 3min。
5、將 20mL EB 形成培養(yǎng)基和 40μL EB 形成補(bǔ)充劑混合均勻獲得 EB 形成wan全培養(yǎng)基。（注意：所用培養(yǎng)基均應(yīng)提前在工作臺放置 30min 以恢復(fù)室溫，后面操作同理。）
6、消化完成后于顯微鏡下可看到克隆發(fā)白發(fā)亮。
7、吸去 人多能干細(xì)胞消化液，每孔加入 1mL EB 形成wan全培養(yǎng)基終止消化。
8、輕輕吹打孔內(nèi)細(xì)胞 2-3 次，將 500uL 細(xì)胞懸液移至有 9mLEB 形成培養(yǎng)基的 15mL 離心管中。
9、100g 離心 5min，吸棄上清。
10、輕彈細(xì)胞沉淀液，加入一毫升 EB 形成wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入 9mLEB 形成wan全培養(yǎng)基，重新制成細(xì)胞懸液。
11、將細(xì)胞懸液移至加樣槽，使用多通道移液器種到超低吸附 96 板中，每孔 100μL，接種 96個(gè)孔，普通 96 孔板每孔加 100μL PBS，96 孔作為配平。
12、于低速水平離心機(jī)，850rpm/120g 離心 3min，將板放入 37℃，5%CO₂ 的培養(yǎng)箱，記為 D-2。
13、第 2 天(D-1）可以看到形成大小均一的 EB。每孔補(bǔ)充 100μL EB 形成培養(yǎng)基（不含補(bǔ)充劑），放入 37℃，5%CO₂ 的培養(yǎng)箱。
（注意：補(bǔ)充 EB 形成培養(yǎng)基后，可將多通道移液器槍頭置于液面下輕輕吹打，在不影響到 EB的情況下混勻培養(yǎng)基。）

②EB 分化階段（12 天）
14、D0，解凍補(bǔ)充劑 A，9.6mL 預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 與補(bǔ)充劑 A、200μL Matrigel 混合均勻，恢復(fù)至室溫后，按每孔 100μL 更換培養(yǎng)基，誘導(dǎo) EB 分化，用多通道移液器輕輕吹打，使 EB懸浮。在 37℃，5%CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 天。
15、D4，解凍補(bǔ)充劑 B，2.5mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1+補(bǔ)充劑 B 混合均勻，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并輕輕移液 8-10 次混勻，使每孔培養(yǎng)基的終體積為 125μL，37℃，5%CO₂ 培養(yǎng) 4 天。
16、D8，解凍補(bǔ)充劑 C，2.5mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1+補(bǔ)充劑 C 混合均勻，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并輕輕移液 8-10 次混勻，使每孔培養(yǎng)基的終體積為 150μL，將 96 孔板放回培養(yǎng)箱，37℃，5%CO₂ 培養(yǎng) 4 天。

③耳泡形成階段（6 天）
17、D12，EB 誘導(dǎo)結(jié)束，準(zhǔn)備好基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2（提前在冰上冷藏至少 30min）；或者，在 D11 上使基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2 存儲在 4°C 過夜。Matrigel 提前與補(bǔ)充劑 D 于 4℃解凍，冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2 與補(bǔ)充劑 D 混合均勻。將 200uL Matrigel 加入 20mL 冷的混合培養(yǎng)基中，反復(fù)吹打溶解 20 次，復(fù)溫到室溫。將 96 孔板中的聚集物轉(zhuǎn)移到兩個(gè) 100mm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中有 48 個(gè)聚集體。用 1-2mL 的 PBS 洗滌聚集體 2 次，再用 1mL 不含 Matrigel 的混合培養(yǎng)基洗滌 1 次，然后分別加入 10mL 含 Matrigel 的混合培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO₂ 培養(yǎng) 3天；D15 吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，重新加入不含 Matrigel 的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 3 天，誘導(dǎo)
耳泡形成；
（注意：10mm 皿一般換液需要 10mL 培養(yǎng)基）

④內(nèi)耳類器官成熟階段（42 天）
18、D18-60，內(nèi)耳類器官逐漸成熟，將培養(yǎng)基換成成熟培養(yǎng)基，開始長期培養(yǎng)，每 5 天換一次液，到 60 天左右獲得具有感覺毛細(xì)胞的成熟內(nèi)耳類器官。

三、內(nèi)耳類器官鑒定圖

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