在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，永生化人類(lèi)淋巴母細(xì)胞 - EBV (KMS-9) 是一種具有價(jià)值的細(xì)胞模型，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)等多個(gè)研究方向。以下將深入探討 KMS-9 細(xì)胞的操作使用要點(diǎn)，助力科研人員更好地開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

KMS-9 細(xì)胞的基本特性

來(lái)源與特性概述

KMS-9 細(xì)胞系源自人類(lèi)外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng) EB 病毒（Epstein - Barr virus）轉(zhuǎn)化后獲得永生化特性。EB 病毒是一種雙鏈 DNA 病毒，能夠感染人類(lèi) B 淋巴細(xì)胞，并通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力。KMS-9 細(xì)胞保留了 B 淋巴細(xì)胞的部分免疫學(xué)特征，如表達(dá) B 細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD19、CD20 等，同時(shí)具有活躍的代謝活性和增殖能力，這使其在研究人類(lèi) B 淋巴細(xì)胞的生物學(xué)功能、腫瘤發(fā)生機(jī)制以及 EB 病毒與宿主細(xì)胞的相互作用等方面具有重要應(yīng)用。

細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)特性

在顯微鏡下觀察，KMS-9 細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，細(xì)胞膜較為清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有少量顆粒。其生長(zhǎng)曲線具有典型的滯后期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。在適宜的培養(yǎng)條件下，KMS-9 細(xì)胞的倍增時(shí)間一般在 24 - 48 小時(shí)左右。細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)活力最佳，此時(shí)細(xì)胞的代謝活性、增殖能力和生物學(xué)功能較為穩(wěn)定，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作的理想階段。

細(xì)胞培養(yǎng)基本條件

培養(yǎng)基的配置與選擇

選擇合適的培養(yǎng)基是 KMS-9 細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。 RPMI-1640 培養(yǎng)基是 KMS-9 細(xì)胞常用的培養(yǎng)基之一，其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等，能夠滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)的基本需求。在使用 RPMI-1640 培養(yǎng)基時(shí)，通常需要添加 10% - 20% 的胎牛血清（FBS），F(xiàn)BS 中的生長(zhǎng)因子、激素和黏附因子等成分能夠進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。此外，還需要添加青霉素 - 鏈霉素溶液（雙抗），以防止細(xì)菌和真菌的污染。

培養(yǎng)環(huán)境的控制

KMS-9 細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求較為嚴(yán)格，適宜的培養(yǎng)溫度為 37℃，相對(duì)濕度保持在 95%左右。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)需要在含有 5% CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，CO?的作用是維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，通常 RPMI-1640 培養(yǎng)基的 pH 值范圍為 7.2 - 7.4。在培養(yǎng)過(guò)程中，需定期檢查培養(yǎng)箱的溫度、濕度和 CO?濃度，確保細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。

傳代操作關(guān)鍵要點(diǎn)

傳代時(shí)機(jī)的判斷

判斷 KMS-9 細(xì)胞的傳代時(shí)機(jī)對(duì)于維持細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和活力至關(guān)重要。一般而言，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 1×10? - 2×10? cells/ml 時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)應(yīng)進(jìn)行傳代操作。若傳代過(guò)晚，細(xì)胞密度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、代謝廢物積累、細(xì)胞活力下降等問(wèn)題；而傳代過(guò)早，則可能使細(xì)胞在新的培養(yǎng)環(huán)境中難以適應(yīng)，影響其正常生長(zhǎng)。

傳代操作步驟

在進(jìn)行傳代操作時(shí)，首先需將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，肉眼觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和培養(yǎng)基的顏色變化。然后，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作，使用離心管收集細(xì)胞懸液，以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速（一般為 1200 - 1500rpm）離心 5 - 10 分鐘，使細(xì)胞沉淀。棄去上清液后，用適量的預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞沉淀 1 - 2 次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清成分。接著，用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照 1:2 - 1:3 的比例進(jìn)行分瓶，將細(xì)胞懸液分別加入新的培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充適量的培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度適宜。最后，將新的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

凍存與復(fù)蘇操作技巧

凍存操作要點(diǎn)

細(xì)胞凍存的目的是在低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間保存細(xì)胞，使其保持良好的活性和生物學(xué)特性。對(duì)于 KMS-9 細(xì)胞，凍存操作需遵循以下要點(diǎn)：

選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。將細(xì)胞收集至離心管中，離心沉淀后棄去上清液。用適量的凍存液（一般含 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜 DMSO）重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度達(dá)到 1×10? - 5×10? cells/ml。將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管 1 - 1.5ml。將凍存管置于 - 80℃冰箱中預(yù)凍 2 - 4 小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存。DMSO 是一種常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，它能夠降低細(xì)胞內(nèi)水的冰點(diǎn)，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而降低冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

復(fù)蘇操作要點(diǎn)

細(xì)胞復(fù)蘇是將凍存的細(xì)胞從液氮中取出并恢復(fù)到常溫生長(zhǎng)狀態(tài)的過(guò)程。復(fù)蘇 KMS-9 細(xì)胞時(shí)，應(yīng)迅速將凍存管從液氮中取出，放入 37℃水浴中快速融化，邊融化邊輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞均勻受熱。待凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液全融化后，立即用酒精棉球擦拭凍存管外壁，將其轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的預(yù)冷培養(yǎng)基，以 1200 - 1500rpm 離心 5 - 10 分鐘，棄去上清液，用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度適宜，放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)基，以去除殘留的 DMSO 和死細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的監(jiān)測(cè)與質(zhì)量控制

細(xì)胞活性檢測(cè)方法

在 KMS-9 細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，定期檢測(cè)細(xì)胞活性是評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)的重要手段。常用的細(xì)胞活性檢測(cè)方法包括臺(tái)盼藍(lán)染色法、CCK-8 法等。臺(tái)盼藍(lán)染色法基于細(xì)胞膜的完整性來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，活細(xì)胞的細(xì)胞膜能夠阻止臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞的細(xì)胞膜則喪失了選擇通透性，臺(tái)盼藍(lán)能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使其染成藍(lán)色。通過(guò)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，可計(jì)算出細(xì)胞的存活率。CCK-8 法則是利用細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶將 CCK-8 中的 WST-8 成分還原為具有橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與細(xì)胞活性呈正相關(guān)，可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值來(lái)定量評(píng)估細(xì)胞活性。

污染監(jiān)測(cè)與防治

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染問(wèn)題是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的常見(jiàn)因素。常見(jiàn)的污染源包括細(xì)菌、真菌、支原體等。為了監(jiān)測(cè)細(xì)胞是否受到污染，需定期觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和培養(yǎng)基的顏色變化。例如，細(xì)菌污染時(shí)，培養(yǎng)基可能會(huì)變混濁，細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn) halo 環(huán)；真菌污染時(shí)，可在顯微鏡下觀察到菌絲或孢子；支原體污染則較為隱蔽，通常需要采用 PCR 檢測(cè)或熒光染色法等專(zhuān)門(mén)的方法進(jìn)行檢測(cè)。為了預(yù)防污染，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，如在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作、使用無(wú)菌的試劑和器械、定期消毒培養(yǎng)箱和工作區(qū)域等。若細(xì)胞受到污染，應(yīng)立即采取措施進(jìn)行處理，如使用適量的抗生素（青霉素 - 鏈霉素、兩性霉素 B 等）進(jìn)行治療，嚴(yán)重污染的細(xì)胞則需及時(shí)廢棄，重新復(fù)蘇或接種新的細(xì)胞。

細(xì)胞鑒定方法

為了確保所使用的 KMS-9 細(xì)胞的準(zhǔn)確性和可靠性，細(xì)胞鑒定是需要的環(huán)節(jié)。常見(jiàn)的細(xì)胞鑒定方法包括流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物、短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分析等。流式細(xì)胞術(shù)可用于檢測(cè) KMS-9 細(xì)胞表面的 CD19、CD20 等 B 細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)情況，從而確認(rèn)細(xì)胞的類(lèi)型和純度。STR 分析則是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞基因組 DNA 中特定的短串聯(lián)重復(fù)序列的長(zhǎng)度多態(tài)性，生成細(xì)胞的 STR 圖譜，與已知的細(xì)胞系 STR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以確定細(xì)胞系的身份，防止細(xì)胞交叉污染或誤認(rèn)等情況的發(fā)生。