本文要點(diǎn)：短波紅外（SWIR）區(qū)域的熒光成像已成為研究哺乳動(dòng)物的重要工具。目前，聚甲炔染料在體內(nèi)成像應(yīng)用中的進(jìn)展主要受限于疏水性和/或非特異性蛋白結(jié)合。本文采用方法結(jié)合親水性與隱匿行為，通過(guò)精確設(shè)計(jì)的聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx）星形聚合物結(jié)構(gòu)構(gòu)建高亮度短波紅外發(fā)射色烯鎓熒光團(tuán)，命名為色烯鎓星（或稱(chēng)"CStars"）。在聚合物屏蔽染料中，含五條POx鏈的變體（CStar30）具有顯著增強(qiáng)的水溶性與短波紅外亮度，可實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)高分辨率短波紅外成像；其體內(nèi)展現(xiàn)的快速腎臟清除特性與隱匿行為還實(shí)現(xiàn)了淋巴系統(tǒng)無(wú)創(chuàng)可視化效果的提升。此外，CStar與FDA批準(zhǔn)染料吲哚菁綠（ICG）促進(jìn)雙色激發(fā)復(fù)用短波紅外成像，可在視頻速率幀數(shù)下實(shí)時(shí)同步觀測(cè)同一活體內(nèi)的流體動(dòng)力學(xué)與蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)。

活體成像

本研究融合隱形聚合物與短波紅外發(fā)射聚甲炔熒光團(tuán)優(yōu)勢(shì)，采用精確設(shè)計(jì)的星形聚合物結(jié)構(gòu)以保持造影劑的分子級(jí)離散性。星形聚合物以共同核心延伸出三條及以上聚合物鏈（"臂"）為特征，相比線性聚合物具有鏈纏結(jié)少、溶液粘度低等性質(zhì)。通過(guò)在星形聚合物核心植入短波紅外發(fā)射熒光團(tuán)，推斷聚合物臂既能提供水溶性和體內(nèi)隱形特性，又可作為分子屏障保護(hù)水環(huán)境中的熒光團(tuán)。由此開(kāi)發(fā)出色烯鎓星形聚合物"CStars"：其核心為高亮度色烯鎓熒光團(tuán)，外圍延伸隱形親水性聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx）聚合物臂（圖1B）。將該材料與吲哚菁綠（ICG）聯(lián)用，最終實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)雙色激發(fā)復(fù)用短波紅外成像，通過(guò)降低蛋白結(jié)合率顯著改變體內(nèi)生物分布與清除速率（圖1C）。

圖1. 用于體內(nèi)成像的聚甲氧基熒光團(tuán)

本研究選用具有優(yōu)異短波紅外亮度的七甲川色烯鎓熒光團(tuán)（Chrom7）作為CStars核心。通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾，使核心色烯鎓骨架攜帶3-5個(gè)末端炔基，以便通過(guò)銅催化點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行聚合物偶聯(lián)。隱形聚合物臂選用疊氮功能化線性聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx），由對(duì)應(yīng)單體聚合而成。本研究聚焦聚合度30的POx鏈，因其在膠束和納米乳劑中展現(xiàn)親水性。采用"耦合接枝"策略將核心熒光團(tuán)與聚合物臂結(jié)合——先獨(dú)立制備各組分再偶聯(lián)，成功制得分子量分布狹窄的星形聚合物（圖2A）。盡管大分子聚合物偶聯(lián)動(dòng)力學(xué)緩慢，但銅催化疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC）在此展現(xiàn)出高效性。

圖2. 點(diǎn)擊化學(xué)法合成鉻烯基星形聚合物（CStars）

為探究星形結(jié)構(gòu)對(duì)染料性能的影響，制備了三種含不同炔基數(shù)目的核心熒光團(tuán)。通過(guò)CuAAC反應(yīng)高效合成了分子量分布極窄（?≤1.02）的CStars（5,6,7），分別含五臂、四臂及三臂POx鏈（圖2B,）。以5號(hào)材料優(yōu)化反應(yīng)條件發(fā)現(xiàn)：當(dāng)每炔基配2當(dāng)量POx聚合物及16% Cu(I)催化劑時(shí)，反應(yīng)數(shù)小時(shí)內(nèi)即可轉(zhuǎn)化。凝膠滲透色譜（GPC）、基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜（MALDI）（圖2C-E）分析表明偶聯(lián)反應(yīng)高效穩(wěn)定，不同批次產(chǎn)物重現(xiàn)性優(yōu)異。隨著聚合物臂數(shù)量減少，尺寸排阻色譜與透析分離難度增加，導(dǎo)致分離收率逐步降低。

圖3. CStars和核心熒光團(tuán)的光物理性質(zhì)

在獲得五臂、四臂及三臂CStars材料（5–7）后，選用極性更強(qiáng)的甲醇（MeOH）直接對(duì)比核心熒光團(tuán)與CStars亮度。值得欣慰的是，所有CStars均保持聚甲炔特征吸收/發(fā)射光譜，且相較對(duì)應(yīng)核心熒光團(tuán)產(chǎn)生約10 nm紅移（最大吸收波長(zhǎng)λmax, abs～ 940 nm）。核心熒光團(tuán)亮度（ΦF X εmax）在所有CStars中也得以維持或提升（圖3D）。這些數(shù)據(jù)共同表明：聚合物臂在改變核心熒光團(tuán)溶解性的同時(shí)，能保留理想光物理特性。隨后評(píng)估了CStars結(jié)構(gòu)抑制非輻射聚集并傳遞亮度至水相的能力。濃度匹配實(shí)驗(yàn)顯示：吸收光譜隨臂數(shù)變化（圖3A），而發(fā)射光譜保持穩(wěn)定（圖3B）。三臂CStar（7）在任何測(cè)試濃度下均未能實(shí)現(xiàn)單體發(fā)光型水相吸收譜。對(duì)比五臂與四臂CStars（5和6）在水中的光物理參數(shù)，5號(hào)材料憑借更高εmax與ΦF占據(jù)優(yōu)勢(shì)（圖3D）。為直接對(duì)比水相短波紅外相對(duì)亮度，在974 nm激發(fā)下測(cè)量了毛細(xì)管中濃度匹配的各CStars變體發(fā)射強(qiáng)度。與光物理測(cè)量結(jié)果一致，5號(hào)材料在1100 nm以上波段展現(xiàn)出短波紅外發(fā)射強(qiáng)度（圖3C）。綜上可得出結(jié)論：五條聚合物臂在水溶性及亮度方面最為理想，遂將五臂色烯鎓星形聚合物（5）命名為CStar30，其中"30"代表每條POx聚合物臂所含MeOx重復(fù)單元數(shù)。

圖4. CStar30和SulfoChrom7在水和蛋白質(zhì)溶液中的比較（光物理性質(zhì)見(jiàn)圖3D）

接下來(lái)研究者評(píng)估了CStar30抵抗蛋白結(jié)合的能力。首先在純水和富含白蛋白及其他生物分子的胎牛血清（FBS）中檢測(cè)CStar30和SulfoChrom7（圖4）。令人振奮的是，CStar30在純水與FBS中均呈現(xiàn)單體吸收特征（圖4A），且短波紅外發(fā)射強(qiáng)度近乎一致（圖4C）。更重要的是，CStar30在純水中優(yōu)異的光物理性質(zhì)在FBS環(huán)境中依然保持穩(wěn)定（圖3D）。相反，SulfoChrom7從純水到FBS環(huán)境中吸收光譜與短波紅外發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生劇烈變化：其在純水中非輻射聚集占據(jù)主導(dǎo)，導(dǎo)致短波紅外發(fā)射近乎消失，而FBS環(huán)境則恢復(fù)了其發(fā)光單體狀態(tài)（圖4B,4D）。既往研究表明ICG存在類(lèi)似現(xiàn)象。

圖5. 小鼠CStar30的單色成像

在確認(rèn)CStar30具備優(yōu)異體外性能后，研究者進(jìn)一步開(kāi)展小鼠活體短波紅外成像實(shí)驗(yàn)（圖5）。活體實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射CStar30（圖5A），立即觀察到腎臟富集現(xiàn)象（圖5B），隨時(shí)間推移膀胱信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)。麻醉狀態(tài)下靜脈注射后血液循環(huán)時(shí)間估測(cè)為10-15分鐘。值得注意的是，當(dāng)小分子聚甲炔染料因蛋白結(jié)合作用主要富集于肝臟時(shí)，CStar30在肝臟僅呈現(xiàn)基礎(chǔ)信號(hào)（圖5E,5F），提示其具有體內(nèi)隱形特性。注射3小時(shí)后整體信號(hào)顯著減弱，1天后基本檢測(cè)不到。處死動(dòng)物后離體器官微弱熒光強(qiáng)度與探針主體已清除的結(jié)果一致。

圖6. CStar30和ICG在小鼠體內(nèi)的雙色激發(fā)多路成像

為深入探究蛋白結(jié)合型與蛋白惰性熒光團(tuán)在活體動(dòng)力學(xué)的差異，采用ICG（蛋白結(jié)合型染料）與CStar30（蛋白惰性染料）進(jìn)行激發(fā)多路復(fù)用雙色成像（圖6A）。選擇ICG因其光譜與CStar30分離，可分別通過(guò)786 nm和974 nm交替激發(fā)，在單一短波紅外發(fā)射窗口實(shí)現(xiàn)雙通道檢測(cè)（圖6B）。該方法支持視頻級(jí)成像速度的雙熒光團(tuán)同步觀測(cè)。盡管ICG主要發(fā)射近紅外光，其微弱發(fā)射尾跡仍可在短波紅外波段顯現(xiàn)（需更高注射濃度）。最終確定15:100 μM（CStar30）的濃度比可有效消除激發(fā)通道串?dāng)_（圖6C），為活體雙色成像奠定基礎(chǔ)。

通過(guò)靜脈或皮下共注射兩種染料，研究者在同一動(dòng)物體內(nèi)直接比較熒光團(tuán)的分布動(dòng)力學(xué)與清除時(shí)程。靜脈注射后，ICG在2分鐘內(nèi)流經(jīng)血管并富集于肝臟（符合蛋白結(jié)合特性），而聚合物屏蔽的CStar30則同時(shí)抵達(dá)腎臟（圖6D）。麻醉狀態(tài)下持續(xù)監(jiān)測(cè)30分鐘發(fā)現(xiàn)：ICG肝臟信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)（圖6D藍(lán)色），CStar30腎臟信號(hào)在10分鐘開(kāi)始下降，30分鐘時(shí)膀胱積聚（圖6D洋紅色）。注射3小時(shí)后，ICG在肝臟、胃腸呈現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)，而CStar30腎臟信號(hào)趨近于零，膀胱殘留微弱。1天后CStar30信號(hào)消失，但I(xiàn)CG在注射2天后仍于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（如肝臟）清晰可見(jiàn)（圖6D藍(lán)色），此為蛋白結(jié)合型染料的典型滯留特征。皮下共注射實(shí)驗(yàn)顯示：兩種染料初期均富集于相同淋巴結(jié)（圖6E紫色），但I(xiàn)CG同步轉(zhuǎn)移至肝臟（圖6E藍(lán)色），而CStar30淋巴結(jié)滯留時(shí)間延長(zhǎng)（注射后10分鐘內(nèi)腎臟/膀胱信號(hào)微弱）。其淋巴結(jié)強(qiáng)信號(hào)可持續(xù)1小時(shí)（圖S29,S30），而ICG在注射2天后仍滯留于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織（圖6E藍(lán)色），CStar30則無(wú)法檢測(cè)。該結(jié)果證實(shí)蛋白結(jié)合會(huì)導(dǎo)致ICG干擾淋巴結(jié)定位及淋巴引流監(jiān)測(cè)的時(shí)效性。

參考文獻(xiàn)

Mobley E B, Lin E Y, Sletten E M. Chromenylium star polymers: Merging water solubility and stealth properties with shortwave infrared emissive fluorophores[J]. ACS Central Science, 2024.

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