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慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用現(xiàn)狀與創(chuàng)新

來源：南京科佰生物科技有限公司 2025年07月31日 17:01

在 CAR-T 細(xì)胞療法等基因治療領(lǐng)域，慢病毒載體的整合位點(diǎn)檢測(cè)是保障臨床安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。慢病毒載體在將治療性基因?qū)爰?xì)胞時(shí)，可能隨機(jī)整合到宿主基因組中，存在插入突變風(fēng)險(xiǎn)，若整合到原癌基因附近，可能誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；若整合到抑癌基因內(nèi)，可能導(dǎo)致其功能失活。因此，F(xiàn)DA、CDE 等監(jiān)管機(jī)構(gòu)明確要求對(duì)慢病毒整合位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

FDA《嵌合抗原受體（CAR）T 細(xì)胞治療的研發(fā)考量》明確推薦對(duì)整合載體產(chǎn)品進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，因整合可能增加延遲不良事件風(fēng)險(xiǎn);《基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》將“插入突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估” 列為非臨床安全性研究的必檢內(nèi)容;《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》明確要求檢測(cè)基因插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)，評(píng)估其與安全性和療效的相關(guān)性。

慢病毒整合位點(diǎn)檢測(cè)方法

目前檢測(cè)慢病毒整合位點(diǎn)的主要平臺(tái)為高深度測(cè)序（NGS)。

Table 1. 主流的慢病毒整合位點(diǎn)檢測(cè)方法比較

標(biāo)準(zhǔn)化的整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品不僅能校準(zhǔn)檢測(cè)方法的靈敏度與準(zhǔn)確性，還能為不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)比對(duì)、方法驗(yàn)證提供“通用標(biāo)尺”。在進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)、性能驗(yàn)證、試劑盒開發(fā)、日常檢測(cè)質(zhì)控中都需要使用標(biāo)準(zhǔn)品。

NIBSC WHO標(biāo)準(zhǔn)品（18/144）

目前商業(yè)化常見的慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品為NIBSC WHO 標(biāo)準(zhǔn)品（18/144），它由NIBSC制備并發(fā)起，聯(lián)合全球13個(gè)國(guó)家的31家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的結(jié)果，確定該標(biāo)準(zhǔn)品包含共計(jì)10個(gè)慢病毒已知整合位點(diǎn)，分布在10條不同的染色體上，該產(chǎn)品面世以來已被眾多國(guó)內(nèi)外檢測(cè)機(jī)構(gòu)用于慢病毒整合位點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目的性能驗(yàn)證及臨床檢測(cè)應(yīng)用中的質(zhì)控。盡管如此該產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用過程中仍存在一些短板和痛點(diǎn),其中包括：

該產(chǎn)品選取公布的位點(diǎn)信息僅來自于31家實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)獲得的較為一致的結(jié)果，不排除有一些潛在的未被公布，對(duì)一些復(fù)雜的非典型的整合和插入方式（例如一端或部分LTR發(fā)生缺失的整合位點(diǎn)）可能存在漏報(bào)；

該產(chǎn)品的參數(shù)來自于多家檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果的綜合和篩選，方法學(xué)上并未明確和統(tǒng)一，也并未就相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)；

該產(chǎn)品只公布了整合位點(diǎn)的染色體位置，而沒有明確插入位置兩端的確切拼接序列，沒有完整精確呈現(xiàn)各位點(diǎn)的插入情況；

該產(chǎn)品并未提供整合位點(diǎn)的位點(diǎn)頻率數(shù)據(jù)，只能作為定性參考品使用，不能直接用于準(zhǔn)確性，精密度，檢測(cè)下限等相關(guān)性能驗(yàn)證；

該產(chǎn)品經(jīng)我們驗(yàn)證是來自于一個(gè)單克隆的核酸樣本，而目前臨床上需要檢測(cè)整合位點(diǎn)的CAR-T樣本多為多克隆樣本。單克隆與多克隆樣本相比存在整合位點(diǎn)較為單一，位點(diǎn)頻率較高容易檢出等特點(diǎn)，因此對(duì)應(yīng)臨床上大量多克隆樣品，整合位點(diǎn)繁多且低頻的特點(diǎn)，該產(chǎn)品并不能很好的模擬實(shí)際樣本的檢測(cè)。

科佰生物自主開發(fā)

針對(duì)上述痛點(diǎn)和缺陷，科佰生物自主開發(fā)了新一代的慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，該產(chǎn)品通過整合關(guān)聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)（IAA）以及常用的靶向捕獲技術(shù)和LAM-PCR三種方式結(jié)合NGS發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品的整合位點(diǎn)，保證了標(biāo)準(zhǔn)品中所有整合位點(diǎn)的準(zhǔn)確完整報(bào)道，進(jìn)一步結(jié)合了一代（Sanger）測(cè)序和數(shù)字PCR，精確定性和定量了所有整合位點(diǎn)的序列及頻率信息，做到了五重驗(yàn)證。

另外為了進(jìn)一步滿足CAR-T細(xì)胞整合位點(diǎn)的臨床檢測(cè)需求，模擬臨床的實(shí)際情況。我們采用了T細(xì)胞來源的細(xì)胞系制備該標(biāo)準(zhǔn)品，并且除了單克隆樣品，還制備了特定低頻（位點(diǎn)頻率低至2%）的多克隆樣本，且包含位點(diǎn)更多，覆蓋的染色體條數(shù)和區(qū)域更廣，可直接用于檢測(cè)方法的性能驗(yàn)證，確定方法精密度，準(zhǔn)確性，檢測(cè)限等指標(biāo)，也更貼合臨床檢測(cè)中的實(shí)際情況。

兩種標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比分析

科佰生物產(chǎn)品特點(diǎn)

高度模擬臨床樣本

T細(xì)胞來源系作為宿主，更貼近CAR-T治療的實(shí)際場(chǎng)景。通過單克隆+多克隆標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置，模擬隨機(jī)整合和多克隆多位點(diǎn)低頻的復(fù)雜性。

多重技術(shù)驗(yàn)證體系

五步正交驗(yàn)證（NGS（整合關(guān)聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)（IAA，靶向捕獲， LAM-PCR）+ Sanger確認(rèn) + dPCR定量），確保位點(diǎn)序列與頻率的準(zhǔn)確性。在驗(yàn)證LTR整合基因組位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證了載體上其他基因序列在基因組上的非典型整合位點(diǎn)。

靈活的頻率梯度設(shè)計(jì)

可提供 5%和2%低頻整合樣本，滿足FDA對(duì)插入突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的靈敏度需求。

標(biāo)準(zhǔn)化與可擴(kuò)展性

單克隆樣本可作為“標(biāo)準(zhǔn)模塊”，按需混合生成多克隆標(biāo)準(zhǔn)品，適應(yīng)不同檢測(cè)需求。

慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品

針對(duì)這一要求，科佰生物推出多款慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。

貨號(hào)	名稱
CBPL0002	Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard
CBPL0003	Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard II (Single site)
CBPL0005	慢病毒整合位點(diǎn)分析參考試劑IV (含有性染色體插入)
CBPL0006	慢病毒整合位點(diǎn)分析陰性參考試劑
CBPL0007	慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-5%
CBPL0008	慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-2%

部分?jǐn)?shù)據(jù)展示：

*為L(zhǎng)TR缺失的非典型整合位點(diǎn)

Fig1.CBPL0007 慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-5%五步正交驗(yàn)證結(jié)果

Fig 2. Results of CBPL0002 by NGS (Probe capture method).

Fig 3.Results of CBPL0002 by Sanger sequencing.

Fig 4.Results of CBPL0002 by ddPCR.

Fig 5.Results of CBPL0003 by Sanger sequencing.

Fig 6.Results of CBPL0005 by Sanger sequencing.

相關(guān)產(chǎn)品

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