大腦具有驚人的分子多樣性，這種多樣性不僅是神經(jīng)元復雜結(jié)構(gòu)特化的基礎(chǔ)，也支撐著神經(jīng)元間復雜的連接與突觸傳遞。要理解這些分子的功能，關(guān)鍵在于解析眾多蛋白的精確定位及其空間關(guān)系。然而，神經(jīng)元精細結(jié)構(gòu)內(nèi)組分高度密集，傳統(tǒng)光學顯微鏡約200 nm的衍射極限阻礙了此類信息的獲取。

超分辨率成像技術(shù)突破了200 nm的傳統(tǒng)光學衍射極限，單分子定位技術(shù)（SMLM）具有20 nm的超高空間分辨率，是研究單個分子定位、蛋白相互作用等的理想工具，可以實現(xiàn)大分子復合物的原位可視化。該技術(shù)可應用于諸如突觸活動區(qū)的分子組織，生長錐和樹突棘中肌動蛋白的排列與膜運輸機制，單分子水平的突觸傳遞與可塑性，腦回路的納米級結(jié)構(gòu)和軸突質(zhì)膜下肌動蛋白和血影蛋白細胞骨架的顯著周期性等不同研究中。

Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)依托前沿的單分子定位顯微成像技術(shù)（SMLM），實現(xiàn)xyz三軸15 nm的超高分辨率，支持同時多色成像；該系統(tǒng)支持 STORM、PALM、PAINT 等單分子定位技術(shù)，并融入ASTER大視野成像、光譜拆分多色成像及Ultimate 3D成像技術(shù)，構(gòu)建了一個強大易用的一體化平臺，助力神經(jīng)科學家準確解析神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)與功能的納米級分子機制。

3D單分子超分辨成像系統(tǒng)

本文將從納米級突觸表型檢測、膜相關(guān)周期性骨架和軸突起始段的結(jié)構(gòu)組成三方面應用入手，介紹Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)在神經(jīng)科學領(lǐng)域的應用。

納米級突觸表型檢測

圖1   突觸的多通道成像

橙色：囊泡GABA轉(zhuǎn)運蛋白；藍色：Bassoon管蛋白

不同突觸間神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過程存在顯著差異，為探究這種差異是否與釋放過程中蛋白質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，J. Burrone 等^[1] 利用Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)，通過多色單分子定位技術(shù)對SypHy-RGECO（一種能同步檢測突觸前鈣離子內(nèi)流與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的雙重報告蛋白）進行成像，旨在研究單個突觸前小體的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。

通過 Cav2.1 和巴松管蛋白（Bassoon）與 SypHy-RGECO的雙色 dSTORM 超分辨成像，研究者發(fā)現(xiàn)這兩種活性區(qū)蛋白均以亞突觸結(jié)構(gòu)域（SSDs）的形式存在。在代表單個突觸前小體的 SypHy-RGECO 團簇內(nèi)，可包含 1 至 6 個 Cav2.1   SSD（均值=1.6，圖 2A）或 Bassoon SSDs（均值=1.7，圖 2B）。利用基于單分子檢測密度的分析軟件 Point Cloud Analyst 分析表明：含多個Cav2.1 SSDs的突觸，其SypHy 團簇體積更大（圖 2C）；含多個Bassoon SSDs的突觸，其SypHy 團簇體積差異更為顯著（圖 2D）。

這些結(jié)果表明，突觸可通過不同方式組織蛋白：既可形成單個SSD，也可構(gòu)建具有不同密度的多個SSD。此類精細結(jié)構(gòu)在傳統(tǒng)光學顯微鏡下無法觀測，凸顯了單分子定位技術(shù)在揭示突觸蛋白組織機制方面難以超越的優(yōu)勢，而 Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)憑借其超高分辨率，為觀測此類精細結(jié)構(gòu)提供了有力支撐。

圖2   SypHy-RGECO團簇內(nèi)的Cav2.1和Bassoon

J. Burrone等之后的一項研究^[2]表明，海馬CA1區(qū)基底樹突在起層（stratum oriens）形成的突觸中，約半數(shù)屬于多突觸小泡（MSB）—— 即單個突觸前小泡與來自不同細胞的多個（2-7個）突觸后棘形成興奮性連接。這類突觸數(shù)量龐大且具有特殊形態(tài)，此外單個MSB內(nèi)部各突觸接觸點的特性差異，遠小于相鄰單突觸小泡（SSB）之間的異質(zhì)性，這表明MSB通過其眾多接觸點傳遞相似的信息，暗示它們可能在促進神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化活動中發(fā)揮作用。

研究人員使用STORM技術(shù)對標記了兩種突觸前分子 —— vGlut-1和Bassoon進行成像，分析多個樣本中MSB的分布情況（圖3）。結(jié)果顯示，vGlut-1呈現(xiàn)出突觸終端前小泡輪廓，而Bassoon染色則如預期呈現(xiàn)更明顯的點狀分布（圖3A、3B）。通過Abbelight Neo軟件的團簇分析功能發(fā)現(xiàn)，相較于SSB，MSB的vGlut團簇具有更大的體積（圖3C），但Bassoon團簇體積無顯著變化（圖3D）。更重要的是，MSB內(nèi)部的Bassoon團簇體積離散度顯著低于不同SSB間的離散度（圖3E），這與MSBs活性區(qū)尺寸變異減小的測量結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)共同表明，MSBs通過各接觸點向多個細胞傳遞相似的信息，而 Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)的精準成像和配套分析軟件的強大功能，為該研究結(jié)論的得出提供了可靠依據(jù)。

圖3   多突觸小泡內(nèi)部活性區(qū)的特性相似度顯著高于單突觸小泡

J. Burrone等的另一項研究^[3]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育中的海馬CA1神經(jīng)元基底樹突上，興奮性和抑制性突觸的分布呈現(xiàn)高度相關(guān)性。這種緊密關(guān)聯(lián)在神經(jīng)元發(fā)育早期（P7階段）最為顯著——此時抑制性突觸在分子和生理功能上均未成熟，而隨著興奮性突觸密度的增加，兩者的相關(guān)性會逐漸減弱。

研究人員發(fā)現(xiàn)，P7階段神經(jīng)遞質(zhì)釋放失敗率相較于更成熟的P21階段更高。為深入探究這一現(xiàn)象，研究人員使用dSTORM對vGAT標記的突觸前小泡進行超分辨率成像（圖4A），發(fā)現(xiàn)vGAT點狀團簇結(jié)構(gòu)的體積在各階段均無顯著差異（圖4B），證實抑制性突觸在發(fā)育過程中未發(fā)生明顯變化。接下來對普遍存在于所有突觸小泡的活性區(qū)標志物Bassoon進行成像（圖4C）并用Abbelight Neo軟件進行共定位分析，發(fā)現(xiàn)在P7階段僅有約40%的內(nèi)源性vGAT（白色）點狀團簇含有Bassoon（紅色）（圖4C行2）或另一關(guān)鍵活性區(qū)蛋白RIM1/2（紅色）（圖4C行3）。到P10階段時，絕大多數(shù)（約90%）vGAT陽性突觸已能清晰標記這兩種活性區(qū)標志物，且這種共定位在P21階段仍保持高度穩(wěn)定（圖4C）。以上結(jié)果表明，在P7階段，基底樹突上的大多數(shù)抑制性突觸尚未成熟，其活性區(qū)未完全形成。Abbelight   3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)的高分辨率成像能力和精準的共定位分析功能，使得這種突觸發(fā)育過程中的細微變化得以清晰呈現(xiàn)。

圖4   抑制性突觸早期發(fā)育時的組成變化

膜相關(guān)周期性骨架

C. Leterrier等^[4]通過多種單分子定位超分辨顯微技術(shù)，借助神經(jīng)元培養(yǎng)體系中經(jīng)驗證的微珠誘導突觸前膜模型，實現(xiàn)了對突觸前肌動蛋白的納米級結(jié)構(gòu)解析和定量檢測，發(fā)現(xiàn)了一類主要的肌動蛋白富集型突觸前膜，存在三種特征性的肌動蛋白結(jié)構(gòu)：活躍區(qū)域的肌動蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（actin mesh）、連接活躍區(qū)與深層儲備池的肌動蛋白軌道狀結(jié)構(gòu)（actin   rails），以及環(huán)繞整個突觸前區(qū)的肌動蛋白圍欄狀結(jié)構(gòu)（actin corrals）。這類突觸不僅聚集了更多突觸前組分，其突觸小泡循環(huán)速率也顯著高于非富集型突觸。

為精確解析肌動蛋白與突觸前組分的空間關(guān)系，研究人員采用了三色STORM/PAINT聯(lián)用成像技術(shù)：先通過STORM對肌動蛋白成像，再運用雙色DNA-PAINT技術(shù)分別標記沿軸突干形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的血影蛋白β2-spectrin和勾勒突觸小泡群的突觸素synapsin。結(jié)果證實血影蛋白膜下支架終止于突觸小泡處，而肌動蛋白圍欄結(jié)構(gòu)包裹著突觸小泡團簇，其軌道狀結(jié)構(gòu)指向活性區(qū)（圖5A）。通過STORM納米成像比較肌動蛋白富集型（A+）與非富集型（A-）誘導突觸前膜的差異顯示，A+與A-型誘導突觸前膜均含有三種肌動蛋白納米結(jié)構(gòu)（網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、軌道狀結(jié)構(gòu)和圍欄狀結(jié)構(gòu)）（圖5B）。進一步檢測包被微珠誘導的興奮性與抑制性突觸前膜是否均存在這三類肌動蛋白納米結(jié)構(gòu)，通過抗VGLUT與VGAT抗體標記發(fā)現(xiàn)，兩類誘導突觸前膜的肌動蛋白納米結(jié)構(gòu)無定性差異，絕大多數(shù)都含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、軌道狀結(jié)構(gòu)和圍欄狀結(jié)構(gòu)（圖5E-F）。Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)支持多種成像模式，能夠精準解析復雜的分子空間關(guān)系，為研究膜相關(guān)周期性骨架提供了強大的技術(shù)支持。

圖5   各類誘導型突觸前膜中均存在肌動蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、軌道狀結(jié)構(gòu)與圍欄狀結(jié)構(gòu)。

軸突起始段的結(jié)構(gòu)組成

在哺乳動物的軸突性樹突（AcD）神經(jīng)元中，軸突并非起源于胞體，而是從基底樹突發(fā)出，進而在軸突起始段（AIS）形成動作電位產(chǎn)生的特化通路。然而目前尚不明確這種特殊形態(tài)是如何建立的，以及AcD神經(jīng)元中AIS的結(jié)構(gòu)與功能是否得以保留。

K. Grünewald等^[5]采用離體海馬神經(jīng)元培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)AcD形態(tài)的發(fā)育可發(fā)生在突觸形成之前，且不依賴于體內(nèi)環(huán)境。單個前體神經(jīng)突首先形成軸突，隨后發(fā)育為AcD。該AIS具有與胞體源AIS相似的細胞骨架結(jié)構(gòu)，同樣作為運輸屏障維持軸突特異性分子組成。然而，它不經(jīng)歷穩(wěn)態(tài)可塑性，所含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池狀細胞器（cisternal organelles）更少，并且接收的抑制性輸入也較少。這些結(jié)果揭示了AcD神經(jīng)元的生物學特性，并表明了AIS結(jié)構(gòu)特征可能因軸突起源不同而存在差異。

軸突起始段（AIS）的另一結(jié)構(gòu)特征是包含膜相關(guān)周期性骨架（MPS）的膜下F-actin環(huán)以及胞內(nèi)F-actin斑塊。研究人員為深入解析膜相關(guān)周期性骨架MPS的結(jié)構(gòu)特征，在AcD神經(jīng)元中進行了βIV-spectrin與F-actin的dSTORM成像，發(fā)現(xiàn)其軸突起始段（AIS）的βIV-血影蛋白同樣形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，相鄰條帶間距約196 nm，且F-肌動蛋白與βIV-血影蛋白條帶呈互補分布模式（圖6），該結(jié)果與非AcD神經(jīng)元的既往研究一致，表明AcD神經(jīng)元中樹突起源的軸突并未改變其AIS區(qū)域的微管和MPS的納米結(jié)構(gòu)。Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)的高分辨率和精準的成像能力，讓軸突起始段這種精細的結(jié)構(gòu)組成得以清晰展示。

圖6   使用Abbelight光譜拆分技術(shù)實現(xiàn)軸突起始段的多通道成像

參考文獻：

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