1. Q:競(jìng)爭(zhēng)ELISA、雙抗夾心ELISA、間接ELISA都是什么?有什么區(qū)別?
A:
競(jìng)爭(zhēng)ELISA | 雙抗夾心ELISA | 間接ELISA | |
特點(diǎn) | 包被抗體,標(biāo)記抗原,樣本中的抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固體抗體結(jié)合,標(biāo)本中抗原量含量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少,最后的顯色也越淺。 | 使用兩個(gè)特異性單抗或者1個(gè)特異性單抗和1個(gè)特異性多抗,固相載體包被抗體,酶標(biāo)記特異性抗體作為檢測(cè)抗體。 | 固相載體包被抗原,酶標(biāo)記二抗,主要用于測(cè)抗體。 |
優(yōu)點(diǎn) | 可適用比較不純的樣本,而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。 | 使用兩個(gè)特異性抗體檢測(cè),特異性好。 | 使用酶標(biāo)二抗增加了靈敏度,靈活度大,成本低。 |
缺點(diǎn) | 整體的敏感性和專一性都較差。 | 成本高。 | 交叉反應(yīng)幾率升高。 |
用途 | 小分子抗原或者半抗原的定量檢測(cè),當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易去除或不易得到足夠的純化抗原時(shí),多用于此方法檢測(cè);一般小分子激素及藥物常用此法測(cè)定。 | 用于抗原的定量檢測(cè)。 | 通過檢測(cè)血清中的抗體來檢測(cè)病毒,如第1,2代艾滋病診斷試劑。常用于免疫動(dòng)物血清中抗體含量的測(cè)定。 |
2. Q:為什么推薦雙波長(zhǎng)檢測(cè)(450nm和630nm)。
A:ELISA實(shí)驗(yàn)終止后形成的是黃色物質(zhì),該物質(zhì)需要在450nm處測(cè)定其吸光度,630nm的吸光度只是檢測(cè)板子本身的吸光度,與酶標(biāo)板的材質(zhì)有關(guān),測(cè)OD630可以消除各個(gè)板孔不干凈等非特異性因素引起的誤差。如果所使用的酶標(biāo)儀不可以檢測(cè)OD630也沒有關(guān)系,只讀取OD450的結(jié)果也可以。
數(shù)據(jù)處理時(shí)所用的矯正值,是把所有孔的OD值減去標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度孔的OD值,進(jìn)一步計(jì)算結(jié)果。
3. Q:CV值指的是什么?
A:CV值是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的一個(gè)概念,中文是變異系數(shù),可以認(rèn)為變異系數(shù)和極差、標(biāo)準(zhǔn)差和方差一樣,都是反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對(duì)值。CV值越小,說明數(shù)據(jù)的波動(dòng)程度越小。在描述板內(nèi)、板間實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致時(shí)常用到CV值,其越小,說明批內(nèi)及批間差越小,試劑盒質(zhì)量越好。
4. Q:標(biāo)曲擬合方式。
A:ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標(biāo)準(zhǔn)曲線”其實(shí)稱為擬合曲線比較合適。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式有多種,直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對(duì)數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合,但都只適用于曲線的一部分,有的適用于前半段,有的適用于后半段,有的適用于中間一段,而四參數(shù)Logistic曲線擬合則對(duì)曲線的全部都有較好的適用性。目前國際上流行的免疫檢測(cè)擬合方式是“四參數(shù)Logistic擬合",用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系,從而進(jìn)一步比較正確地獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度值。
建議用專門的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,這樣可以快速、準(zhǔn)確地計(jì)算出結(jié)果。
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