一、背景

大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分離自肝臟組織；采用混合酶灌流消化、反復(fù)低速離心、密度梯度離心法，并通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來；細(xì)胞經(jīng)Dil-Ac-LDL免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（SEC）是肝臟內(nèi)所占比例的非實質(zhì)細(xì)胞，位于肝竇腔與肝細(xì)胞之間，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能。

SEC由于擁有一般細(xì)胞所沒有的窗孔結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間連結(jié)松散、內(nèi)皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，從而達(dá)到快速交換各種大小分子的目的。肝在遭到多種病原侵襲時，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔逐漸減少或消失，內(nèi)皮下基膜形成，產(chǎn)生類似于連續(xù)型毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)，這一過程稱為肝竇毛細(xì)血管化。它由多種因素引起，其過程極復(fù)雜，在多種肝病的發(fā)病前期階段均有出現(xiàn)，近年來受到廣泛關(guān)注。

二、大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇與鋪板

1、將15ml離心管插入盛有足量碎冰的冰盒中，紫外消毒15min；4℃預(yù)冷離心機。

2、復(fù)蘇培養(yǎng)基放碎冰中充分預(yù)冷，鋪板培養(yǎng)基放入38℃恒溫水浴鍋中充分預(yù)熱。

3、將凍存的細(xì)胞從冷藏位置迅速轉(zhuǎn)移至38℃恒溫水浴鍋中。盡可能多的浸入38℃水中，順時針?biāo)綋u動，但必須確保凍存管管蓋保持在水面以上。

4、解凍凍存管約90-120s，至凍存管中只有少量碎冰漂浮即可。

5、用75%酒精消毒凍存管，并將其轉(zhuǎn)移到生物安全柜。

6、用寬口槍頭將大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞重懸（輕輕吹打2次），并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的15ml離心管中（注意：凍存管與槍頭上殘留細(xì)胞，可用1ml復(fù)蘇培養(yǎng)基清洗凍存管與槍頭）。

7、向細(xì)胞懸液逐滴加入預(yù)冷復(fù)蘇培養(yǎng)基，每1ml細(xì)胞懸液加入10ml復(fù)蘇培養(yǎng)基（注意：前3ml要緩慢逐滴加入并輕微搖晃，后面7ml可加快速度），最后輕微上下顛倒1次混勻。

8、300×g，4℃離心5min，去上清并用培養(yǎng)基重懸。

9、沉淀的細(xì)胞用肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸并定容至4ml，用臺盼藍(lán)排除法測定細(xì)胞的存活率和細(xì)胞總量。

10、將細(xì)胞按3×104cells/cm2接種至膠原包被培養(yǎng)板中。搖勻，在37℃/5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液。

三、大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

1、大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞融合度達(dá)到80%時可進(jìn)行傳代。

2、提前將培養(yǎng)基、PBS、胰酶放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，用75%酒精擦拭后再放入超凈臺內(nèi)。

3、吸除舊培養(yǎng)液，加少量PBS潤洗細(xì)胞，適量胰酶，使加入的胰酶能蓋住細(xì)胞，37℃孵育，約2~3min。

4、顯微鏡下觀察，待貼壁細(xì)胞間間隙變大、細(xì)胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶，加入新鮮肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，晃動細(xì)胞瓶，終止胰酶作用，用吸管小心吹打貼壁的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（控制吹打的力度，避免產(chǎn)生大量的氣泡）。

5、300×g，室溫離心5min，去上清并用培養(yǎng)基重懸。

6、將細(xì)胞懸液按3×104cells/cm2接種到新的膠原包被培養(yǎng)瓶/板內(nèi)，置37℃/5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天觀察貼壁生長情況。

四、應(yīng)用

大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞可以用于天麻素調(diào)控p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路減輕小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的機制研究：

探討GSTD在LSECs氧化損傷中的保護(hù)作用及其分子機制,為臨床HIRI的防治提供理論依據(jù)。

方法：首先使用1mM H2O2構(gòu)建LSECs的氧化應(yīng)激模型,同時給予1、10及50μM GSTD處理細(xì)胞,通過檢測ROS、MDA的含量,評價了GSTD在LSECs氧化應(yīng)激過程中的緩解作用;通過TUNEL法、Annexin V-FITC-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡,觀察GSTD處理對H202誘導(dǎo)的LSECs凋亡的影響,并通過western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);其次,我們使用10mM的SB 203580和1mM的Znpp分別處理細(xì)胞,通過western blot檢測了p38MAPK/Nrf2/HO-1這一氧化應(yīng)激相關(guān)通路的蛋白變化,并進(jìn)行了氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測;

進(jìn)一步構(gòu)建了Nrf2過表達(dá)及Nrf2和HO-1的siRNA敲減細(xì)胞模型,通過核質(zhì)分離和免疫共沉淀檢測Nrf2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的變化,驗證GSTD通過p38MAPK調(diào)控Nrf2/HO-1在抗氧化損傷過程中的作用;

此外,GSTD腹腔灌注后建立小鼠HIRI模型,通過檢測血清中AST、ALT水平及肝臟組織HE染色,觀察GSTD對肝臟損傷的保護(hù)作用;通過TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況;檢測小鼠組織中MDA和SOD的含量;RT-PCR和Western blot分別檢測了小鼠肝臟組織中HO-1、Nrf2、IL-6和TNF-α的mRNA及蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)一步研究了GSTD對小鼠HIRI的保護(hù)作用。

結(jié)果：首先在體外實驗中發(fā)現(xiàn),在H202誘導(dǎo)LSECs的氧化應(yīng)激模型中,經(jīng)GSTD預(yù)處理的LSECs中ROS和MDA的含量降低,提示GSTD能抑制H202誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激;TUNEL法、Annexin V-FITC-PI雙染法檢測發(fā)現(xiàn)GSTD處理后的細(xì)胞凋亡水平降低,提示GSTD對于H202誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用;其次,研究提示GSTD抑制H202誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)是通過促進(jìn)p38 MAPK的磷酸化從而激活Nrf2/HO-1通路實現(xiàn)的。GSTD處理后,p38 MAPK的磷酸化水平顯著上升,并且高濃度的GSTD能夠抵消p38MAPK抑制劑的作用。

同時GSTD能使Nrf2、HO-1的表達(dá)水平顯著上調(diào)。利用shRNA敲低Nrf2的表達(dá)后,HO-1的表達(dá)隨之降低,同時TUNEL陽性細(xì)胞的比例上升,ROS和MDA含量顯著上升。核質(zhì)分離及免疫共沉淀結(jié)果顯示,GSTD在氧化應(yīng)激刺激下調(diào)控Nrf2的主要途徑是誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位。小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,HIRI造成了肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、肝臟細(xì)胞凋亡、壞死,而GSTD的預(yù)處理能夠降低血清AST、ALT水平,減輕肝細(xì)胞壞死、凋亡、降低MDA水平,增加SOD活性,上調(diào)Nrf2和HO-1的表達(dá),下調(diào)IL-6和TNF-α的表達(dá),提示GSTD預(yù)處理在小鼠HIRI中發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。

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