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【超離應(yīng)用大放送】超速離心助力基孔肯雅病毒疫苗研究
CHIKV的傳播途徑
近日，佛山市感染基孔肯雅熱（CHIKV）的病例已經(jīng)超過(guò)4000例，引起公眾的極大關(guān)注。CHIKV主要依靠埃及伊蚊和白紋伊蚊叮咬傳播，已經(jīng)傳染超過(guò)110個(gè)國(guó)家。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，自2005年基孔肯雅病毒重新出現(xiàn)以來(lái)，它已在全球造成超過(guò)200萬(wàn)例嚴(yán)重急性和慢性關(guān)節(jié)炎病例。
CHIKV的上市疫苗
目前有兩種CHIKV疫苗已用于幾個(gè)國(guó)家的高危人群，但是尚未廣泛使用，目前受到較高不良反應(yīng)率和存儲(chǔ)條件的限制。在暫無(wú)特效藥的情況下，開(kāi)發(fā)成熟可靠的疫苗對(duì)于疫情的防控仍然至關(guān)重要。
參考文獻(xiàn)：
Chikungunya virus and other emerging arthritogenic alphaviruses
作為病毒純化經(jīng)典方法學(xué)的超速離心法，廣泛應(yīng)用于各種蟲(chóng)媒病毒的純化（點(diǎn)擊了解更多蟲(chóng)媒病毒的超離純化方法：超速離心在蟲(chóng)媒病毒中的應(yīng)用）。在CHIKV疫苗的研究工作中，超速離心仍然是主要的純化方法之一。
純化流程示意圖
昆蟲(chóng)細(xì)胞系中CHIKV-VLP的純化
1
通過(guò)向培養(yǎng)基組分中加入7%（w/v）聚乙二醇（PEG）-6000和0.5M NaCl，從培養(yǎng)基中沉淀VLP和其他蛋白質(zhì)組分，并在4°C的滾筒臺(tái)上孵育2小時(shí)。
2
在4°C下以4000×g離心沉淀15分鐘，并將沉淀溶解在4°C的1ml GTNE緩沖液中。
3
在4°C的GTNE梯度中制備不連續(xù)的70%（w/v），40%（w/v）蔗糖梯度液。
4
小心地將1 ml VLP溶液加載到40%蔗糖部分的頂部，不要破壞梯度。
5
在4°C的超速離心機(jī)中以70,000×g離心2小時(shí)。
6
小心地分離40-70%蔗糖界面處的VLP條帶并將其重懸于5 ml GTNE緩沖液中。
7
在4°C的超速離心機(jī)中以85,000×g離心30分鐘沉淀VLP，重懸于50μl GTNE中，然后儲(chǔ)存在-80°C以供后續(xù)分析和使用。
參考文獻(xiàn)：
Production of Chikungunya Virus-Like Particles and Subunit Vaccines in Insect Cells
衣殼完全缺乏的CHIKV減毒活疫苗純化
突變型（A）和野生型（B）CHIKV病毒粒子的密度梯度餾分組分qRT-PCR和特異性抗體蛋白質(zhì)印跡測(cè)定結(jié)果
在30 hpi或96 hpi下，4°C，400×g離心10分鐘和5,000×g離心20 min收集上清液。
0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾，4°C下，以8%的終濃度聚乙二醇8000過(guò)夜沉淀上清液。
在4°C下以14,000×g離心1小時(shí)，使用移液器將沉淀輕輕重懸。
將懸浮液覆蓋在20至60%線(xiàn)性蔗糖梯度上，并在Optima MAX-XP超速離心機(jī)中使用MLS-50轉(zhuǎn)子在4°C下以34,000rpm超速離心3小時(shí)。
從梯度中回收病毒組分。從上到下收集10 個(gè)500 μl餾分。
參考文獻(xiàn)：
Infectious Chikungunya Virus (CHIKV) with a Complete Capsid Deletion: a New Approach for a CHIKV Vaccine
硫酸纖維素色譜（Column）將病毒濃度提高100倍，然后在不連續(xù)的蔗糖梯度中進(jìn)行超速離心（gradient）去除雜質(zhì)，再通過(guò)考馬斯染色檢測(cè)病毒
兩步法高度純化EILV/CHIKV嵌合病毒
通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾培養(yǎng)基，室溫下通過(guò)硫酸纖維素（AMSBIO）色譜柱。上樣整個(gè)體積的培養(yǎng)基后，用PBS洗滌色譜柱，并在最小體積（1-1.5 ml）的7xPBS中洗脫病毒。立即將其加載到新鮮制備的蔗糖梯度（1.5 ml 50%、2 ml 40%和7 ml PBS制備的30%）的頂部，并以36,000 rpm、4°C離心3.5小時(shí)。收集一條清晰可見(jiàn)的條帶，用PBS稀釋?zhuān)⒌确衷嚇觾?chǔ)存在-80°C。
已經(jīng)上市的IXCHIQ疫苗生產(chǎn)也采用類(lèi)似的層析+密度梯度超速離心的兩步法進(jìn)行純化。
參考文獻(xiàn)：
Optimized production and immunogenicity of an insect virus-based chikungunya virus candidate vaccine in cell culture and animal models
Chikungunya Virus Vaccines: A Review of IXCHIQ and PXVX0317 from Pre-Clinical Evaluation to Licensure
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