病毒轉(zhuǎn)染，是以病毒載體介導(dǎo)的一種高效的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，其將外源基因包裝到病毒的外殼中，利用病毒的天然感染性，從而將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞當(dāng)中，使外源基因在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。根據(jù)病毒載體不同，常見的分為腺病毒（Adenovirus，ADV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus，RV）、腺相關(guān)病毒（AAV）。目前實(shí)驗(yàn)室用的比較多，使用范圍廣的是慢病毒，接下來，我們就講講慢病毒。

▲慢病毒結(jié)構(gòu)示意圖

慢病毒含有復(fù)雜的基因組。以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為例，HIV-1是一種單鏈RNA病毒，共有9個(gè)基因?；蚪M兩端各有一個(gè)反向末端重復(fù)序列(LTR)，中間包括gag、 pol、env 3個(gè)編碼病毒的結(jié)構(gòu)基因，tat、rev2個(gè)調(diào)節(jié)基因， vif、vpr、vpu、nef 4 個(gè)輔助基因。隨著對(duì)慢病毒基因組的深入研究以及轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)慢病毒基因組進(jìn)行編輯，將其基因分布在不同的質(zhì)粒中，在安全性和包裝能力方面不斷改進(jìn)，從而衍生了第一代、第二代、第三代慢病毒系統(tǒng)。其中第二代三質(zhì)粒系統(tǒng)和第三代的四質(zhì)粒系統(tǒng)是目前大家應(yīng)用比較多，比較廣的。以第二代的三質(zhì)粒系統(tǒng)為例，該系統(tǒng)包含1個(gè)包裝質(zhì)?！幋aGag、Pol、Rev 和Tat 基因, 產(chǎn)生病毒顆粒；一個(gè)包膜質(zhì)粒—Env或VSV-G表達(dá)病毒糖蛋白,提供受體結(jié)合蛋白；以及一個(gè)穿梭質(zhì)粒—帶有外源目的基因。下圖是第二代和第三代慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)示意圖。

圖左：第二代慢病毒包裝系統(tǒng)示意圖              

圖右：第三代慢病毒包裝系統(tǒng)示意圖

為了使靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率更高，前期需要獲得高滴度的慢病毒，也就是需要進(jìn)行慢病毒的復(fù)制包裝。通常情況下，將3質(zhì)粒按照一定比例添加，共同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中孵育，48-72小時(shí)后，將含有該病毒的上清液離心收集，或進(jìn)一步濃縮病毒。

▲慢病毒結(jié)構(gòu)示意圖

慢病毒感染細(xì)胞的第一步是通過其表面的包膜蛋白與宿主細(xì)胞吸附并與表面受體結(jié)合。與宿主細(xì)胞膜融合后，釋放病毒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白以及病毒核心。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，慢病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物。隨之整合前復(fù)合物進(jìn)入宿主細(xì)胞核后，整合酶催化其整合至宿主細(xì)胞基因組。最后外源基因前啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其在宿主細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

▲慢病毒感染宿主細(xì)胞示意圖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染一些標(biāo)記的熒光基團(tuán)(GFP/mCherry/RFP等)，篩選出來的目的細(xì)胞帶有熒光蛋白。細(xì)胞在吸收熒光激發(fā)能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其恢復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式釋放出能量，發(fā)射出一定波長的光?？梢酝ㄟ^倒置熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。

將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞或者導(dǎo)入研究動(dòng)物體內(nèi)后，會(huì)產(chǎn)生熒光素酶(一種可以催化熒光素底物產(chǎn)生熒光的酶)。加入熒光素(底物)，在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素(底物)能夠被氧化發(fā)出綠色或黃色熒光。通過高靈敏生物發(fā)光成像技術(shù)檢測檢測光強(qiáng)度變化。尤其是檢測活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移發(fā)展過程。

體外分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞，通過某種方法如病毒感染、輻射或者化學(xué)致癌作用，打破細(xì)胞原有的分裂次數(shù)限制，使其獲得一定分裂生長的能力，延緩細(xì)胞衰老死亡。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞內(nèi)，從而獲得具有無限增殖能力且細(xì)胞間無差異的永生化細(xì)胞株。