奇異變形桿菌（Proteus mirabilis， PM）是一種能導致人和動物感染的重要條件致病菌。近年，隨著PM造成人類食物中毒的事件及畜禽發(fā)病的數(shù)量不斷增多，該菌受到高度重視。隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展和廣泛應用，現(xiàn)在檢測PM的技術多樣，該文對奇異變形桿菌檢測方法進行綜合概述，并簡要綜述了PM的培養(yǎng)特性以及相關檢測手段，以期為今后對PM的有效防控和進一步研究提供科學依據(jù)。

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是一種兩端鈍圓、兼性厭氧、屬于腸桿菌科變形桿菌屬的革蘭氏陰性菌，以桿狀為主，大小為（0.4～0.6） µm×（1.0～3.0） µm，沒有芽抱和莢膜，大小形態(tài)各異，有鞭毛和菌毛，具有粘附性。該菌主要存在于人與動物的體表黏膜與消化道，生成的相關毒素可導致食物中毒，有些可以和化膿性球菌混合感染，引起繼發(fā)性感染等。容易引起尿道炎、腎孟腎炎、中耳炎和菌血癥等多種疾病。1989年，江益民等從病死肉雞中分離到奇異變形桿菌，染病的肉雞表現(xiàn)出熱應激反應，具有較高的發(fā)病率與死亡率。該菌包括內源性與外源性2種傳染方式，通常由污染的水與飼料經(jīng)消化道傳染，或吸人污染的空氣與塵埃經(jīng)呼吸道感染。當飼料霉變、衛(wèi)生狀況差、溫度急劇變化、轉群時容易引起應激反應進而誘發(fā)該病。近年多種動物相繼都感染該菌，如鵪鶉、鴿子、貂，給畜禽養(yǎng)殖場帶來巨大的經(jīng)濟損失。

一、奇異變形桿菌菌落及生化鑒定

1、菌落鑒定

奇異變形桿菌營養(yǎng)要求不高，在不同培養(yǎng)基中，PM的顏色形態(tài)各不相同，該菌不耐熱，通常在55℃的條件下持續(xù)加熱60 min能消除該菌。PM適宜的生長溫度為10～43℃，在這一溫度范圍內均能順利繁殖。若將奇異變形桿菌放在濃度為0.5%～3.0%的瓊脂平板上可表現(xiàn)出遷徙生長現(xiàn)象。在SS瓊脂平板生長時.呈現(xiàn)圓形、扁薄、半透明的菌落，易與其他腸道致病菌混淆;在血瓊脂平板生長時，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，能迅速分解尿素;在麥康凱平板生長時，易于分解單個菌落。在0.1%石碳酸或0.4%硼酸平板生長時，奇異變形桿菌擴散生長受到抑制，形成單個菌落：在固體

平板生長時，其形態(tài)特征為短桿菌與纖細狀長條菌的交替改變，通常將其稱為Swimmer細胞與Swarmmer細胞。相關學者圍繞其生物學特征將其命名為繁殖體與潛生體，英文名稱分別是vegetative cells， VC與Cryptic growth cells，CGC。

2、細菌生化鑒定

生化鑒定是細菌鑒定中最重要也是的一種方法，主要是借助細菌對營養(yǎng)物質分解能力的不同及其代謝產(chǎn)物的差異對細菌進行鑒定，包括蛋白質分解產(chǎn)物試驗、糖分解產(chǎn)物試驗、氧化酶試驗、凝固酶試驗等。將待檢細菌接種至對應的微量生化管內，置于37℃條件下培養(yǎng)，24h后觀察并做好記錄。根據(jù)ATB微生物鑒定系統(tǒng)說明書開展鑒定工作，取接種環(huán)輕輕沽取該菌落，將其放入準備好的滅菌生理鹽水中，借助API麥克法蘭標準比濁管把菌液濃度調為1.5，最后將生化試條加入其中。之后把試條置于溫箱內培養(yǎng)24h，溫度設為37℃，參照ATB微生物鑒定說明書中試條顏色標準評定結果陰陽性，然后把結果錄入生化鑒定軟件內作進一步判斷。該菌較為明顯的生化特點就是尿素酶、硫化氫、苯丙氨酸脫氫酶均呈陽性，此鑒定方法繁瑣復雜、耗時耗力。

二、血清學診斷

1、平板凝集反應檢測法

有學者于2006年為有效方便地對奇異變形桿菌的血清進行流行病學調查，進而建立一種平板凝集反應檢測方法。方法如下：取待檢血清，用PM平板凝集診斷抗原開展平板凝集反應，同時進行陽性對照，陰性對照以及空白對照。當陰性對照結果為陰性，陽性對照結果為陽性，空白對照未發(fā)生自凝現(xiàn)象時對檢驗結果予以判定。此外，選取分離菌制作染色抗原，并與PM陽性血清進行平板凝集反應，記錄好結果。此法能短時間內診斷該菌，進而為奇異變性桿菌的流行病學調查提供了極大便利。

2、免疫熒光抗體診斷法

此法是基于免疫反應的特異性與靈敏性特點，并與顯微鏡技術相結合的一種免疫標記檢測技術，已在現(xiàn)代免疫學研究中廣泛應用。通常選用的標記物包括四甲基異硫氰酸羅達明、異硫氰酸熒光素（FITC）等熒光素。標記物與已知抗體結合作為檢測試劑，共同檢測未知抗原。然后借助熒光顯微鏡可發(fā)現(xiàn)有熒光特異性的相關抗原抗體結婚晚，進而清楚抗原所在具體部位。朱明華等研究了一種直接熒光抗體檢測方法，利用了該菌的外膜蛋白（OMP）、用FITC標記的相關純化IgG以及兔抗雞奇異變形桿菌外膜蛋白高免血清。據(jù)相關研究顯示，此法不僅操作簡便，而且特異性高、敏感性好，為PM的臨床檢測提供了技術保障。

3、酶聯(lián)免疫吸附測定方法

外國學者于1971年通過堿性磷酸酶對相關抗原與抗體進行標記，進而研發(fā)出酶聯(lián)免疫吸附檢測法，即ELISA法。該檢測技術已廣泛應用于病毒的血清學檢測領域，目前也已廣泛應用于細菌學檢驗。2001年，裴標等建立了一種對嗜堿耐鹽奇異變形桿菌病原學鑒定的ELISA法。此法的操作流程如下：把相關抗原或抗體吸附在固載體上面，然后對其進行免疫酶染色處理，底物經(jīng)顯色后可直接通過肉眼觀察結果或則利用分光光度計判斷結果。

三、細菌鑒定分子生物學方法

1、PCR檢測法

該技術具有良好的敏感性與特異性，屬于臨床微生物檢驗的方法。目前，此法已用于很多細菌與病毒感染疾病的早期診斷、相關遺傳病的診斷、基因分析等領域，現(xiàn)已衍生出多種PCR技術，如多重PCR、原位PCR、巢式PCR等。在奇異變形桿菌檢測中PCR技術受到日益重視，外國學者將16SrRNA、ureC等基因作為靶基因，研究出了專門檢測奇異變形桿菌屬的PCR檢測法，為后來該菌的PCR檢測工作打下基礎。圍繞編碼奇異變形桿菌的脲酶調節(jié)子（ureR）的基因序列設計2條引物建立PCR方法，該方法有效區(qū)別了奇異變形桿菌和普通變形桿菌;畢水蓮等發(fā)現(xiàn)了atPD基因、tut基因，將其作為靶基因，研發(fā)出新的PCR法，用于檢測奇異變形桿菌。以上PCR方法均具有快速、準確、靈敏、特異的優(yōu)點。

2、實時熒光定量PCR法

此法英文簡稱為real-time PCR，將熒光基團添加到PCR反應體系內，借助熒光信號積累進而對PCR的整個過程加以實時監(jiān)控，最后利用標準曲線定量分析研究未知模板。此法不僅靈敏度好、特異性好、可重復，而且定量精準、快速，屬于全封閉反應。目前應用較多的real-time PCR檢測方法包括TaqMan探針與SYBR Green標記。畢水蓮0等人于2008年就新發(fā)現(xiàn)的PM菌屬的atpD基因序列設計了相關引物，構建出SYBR Green熒光定量PCR法。ZHANG等于2013年找到了SYBR Green熒光定量PCR法，能快速鑒別PM，并能對該菌的DNA以及細菌數(shù)量進行定量。2017年，史瑞雅等針對雞奇異變形桿菌全基因序列設計了1對特異性引物，建立檢測雞奇異變形桿菌的SYBR Green I LC-PCR檢測方法，該方法可用于雞奇異變形桿菌的監(jiān)測和早期臨床診斷。

3、環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）

日本學者在2000年研發(fā)出一種新的核酸擴增技術，即環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermalamplification，簡稱LAW）。該技術通過在恒溫條件下使用一種能鏈置換的DNA聚合酶以及可以識別靶序列上面6個位點的4個特殊設計的引物，實現(xiàn)對核酸的高效、迅速、特異擴增。由于該技術不佳操作簡便、耗時短、而且靈敏性與特異性好，產(chǎn)物易檢查，已大量應用在食品安全檢測行業(yè)中。蘇良等在2010年研究了一種檢測奇異變形桿菌的LAMP檢測法，它是根據(jù)奇異變形桿菌a酶調節(jié)子編碼基因（ureR）特異序列的6個位點設計出對應的4個LAMP引物。王鵬等在2011年圍繞變形桿菌屬atpD基因序列，設計出對應的6個引物，包括內引物、外引物、環(huán)引物各2個，構建出檢測PM菌屬的LAMP法。此法能檢測普通變形桿菌以及奇異變形桿菌，可直接檢測食品樣品。

四、結束語

奇異變形桿菌造成的畜禽感染事件在近年經(jīng)常發(fā)生，它屬于僅次于沙門氏菌的一種強致病菌?，F(xiàn)在很多學者通過采用新型技術去檢測奇異變形桿菌，如高興等在2013年將UreR基因作為靶基因，利用多重PCR制作出檢測細菌基因芯片的檢測方法，可以檢測11種食源性細菌基因芯片。此法還能對多種病原體與多種基因進行同時檢測與分析。MEZGER等在2015年建立了檢測致病菌的可伸縮的基于DNA的磁性納米顆粒凝集方法，該方法不需要改變溫度就能制備大量的DNA，可用于平行檢測多種病源菌。通過檢測奇異變形桿菌技術的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，為后續(xù)該菌屬的耐藥特征和防控機制研究奠定了基礎，可用于獸醫(yī)臨床分離鑒定以及臨床合理用藥指導，進而減少耐藥菌株產(chǎn)生。

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