器材與試劑

干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器等

具體步驟

1. 水：

細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.

2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-hanks液的配制)：

主要用于免疫組化染色時組織或細胞的漂洗

溶解定容：將藥品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。

移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。

3. 胰蛋白酶溶液：

胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力zui強。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25%，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)。

用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

4. 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液

稱取胰蛋白酶粉末(1：250) 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝，于-20℃保存。

5. 青、鏈霉素溶液：

所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。 分裝于-20℃保存。使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度zui終為100單位/ml。

6. RPMI1640：

溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度zui終各為100單位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，搖勻。

安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。

分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃時兩周有效)。

7. 血清的滅活：

細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

8. HEPES溶液：

HEPES的化學全稱位(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃保存。

注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可*(20ml)加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

9. 谷氨酰胺：

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%，故應(yīng)單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

10. 肝素溶液的配制：

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中zui終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為??℃ 。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml(可加入0.9ml)即可。

11. Ⅰ型膠原酶：

0.1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

12. 明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1%明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克(配成100ml溶液)—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，放置，然后無菌操作分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

13. Hanks液：

稱取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O 0.06g，加H2O至 1000ml

注：Hanks液可以高壓滅菌。分裝于4℃下保存。

14. D-hanks液：

1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升;

2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升;

3液：酚紅：0.02g，用數(shù)滴NaHCO3溶解酚紅

將2，3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分裝于4℃下保存。

15. Giemsa染液：

稱Giemsa粉末0.5克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油(使加入的甘油總量為33ml)。56℃中保溫90~120分鐘。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液。 使用時按要求用PBS稀釋。一般稀釋10倍。