【產(chǎn)品規(guī)格】

 2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

 為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：

 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

 首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻，根據(jù)稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：

情況A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

 1. 取一支 15ml 離心管，先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 D，制成梯度界面。

 2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-550g ，離心 20-30min（注： 根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。

 3. 離心后，此時(shí)離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層。

 4. 用吸管小心吸取上層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

 5. 250g，離心 10min。

 6. 棄上清。

 7. 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 8. 250g，離心 10min。

 9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 10. 差異貼壁法純化細(xì)胞 （1）用樹(shù)突狀細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CDC2015）或樹(shù)突狀細(xì)胞*培養(yǎng)基（產(chǎn) 品編號(hào)：HCDC2015）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或 細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱(chēng)為單核細(xì)胞）。 （3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。 （4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

注：

 a) 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或 2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

 b) *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

 c) 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成 本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選。

 情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下

 1. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，依次小心加入試劑 A、試劑 D（試劑 A 與試劑 D 體積比為 3:2， 試劑總量與稀釋后的樣本量相等），制成梯度界面。

 2. 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（zui大離心力可至 1000g）， 離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心 時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果。加入血液樣本后，樣 本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）。

3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 10。

 【注意事項(xiàng)】

 1. 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

 2. 本實(shí)驗(yàn)不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心 管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì) 變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

 3. 吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

 4. 吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

 5. 分離液用量大于稀釋后的血液樣本時(shí)，分離效果更佳。

 6. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)TBD以尋求幫助。

 【儲(chǔ)存條件及有效期】

 18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

 【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)樹(shù)突狀細(xì)胞提取率大于 80%。

【參考值（參考范圍）】

 本實(shí)驗(yàn) NK 細(xì)胞提取率大于 80%。

 下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

1. 所獲得樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

2. 所獲得樹(shù)突狀細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

3. 所獲得樹(shù)突狀細(xì)胞的鑒定方法

A.流式細(xì)胞技術(shù)

B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè)”，并在說(shuō)明書(shū)項(xiàng)目欄下下載使用。

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

3. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，

離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。